本文要点：脑炎是一种危及生命的神经系统疾病，具有高死亡率和致残性。受到血脑屏障阻碍以及仅关注症状缓解的因素，当前的干预措施未能解决疾病进展的核心驱动因素：铁死亡和活性氧介导的神经毒性。在此，研究者提出 CeO₂ / 3TT@NP - RVG，一种为脑炎一体化诊疗而设计的多功能纳米材料。该纳米平台包含了清除ROS的CeO₂和具有光热特性的NIR-II发射纳米粒子（3TT），能够实现具有深部组织分辨率的脑炎实时荧光成像。通过狂犬病病毒糖蛋白衍生肽(RVG)的功能化修饰，确保了血脑屏障穿透和神经元靶向递送。在脂多糖诱导的脑炎模型中，CeO₂ / 3TT@NP - RVG 展现出双重治疗效果：通过中和ROS缓解氧化应激，抑制促炎细胞因子，并通过泛素化介导的 POR-ACSL4-LPCA3 通路下调抑制铁死亡，从而减少多不饱和脂肪酸过氧化。这些协同作用显著提高了生存率并减轻了神经炎症。研究者的研究结果凸显了CeO₂ / 3TT@NP - RVG 作为一个开创性的治疗平台，将基于分子机制的治疗与精准成像相结合，为脑炎及相关神经系统疾病提供了一种变革性策略。

方案1. CeO₂ / 3TT@NP - RVG纳米平台通过抑制铁死亡和抗炎调节缓解脑炎的示意图

在本研究中，研究者开发了CeO₂ / 3TT@NP - RVG纳米材料作为评估和治疗脑炎的一站式解决方案。CeO₂组分作为抗氧化剂通过清除ROS，缓解氧化应激。同时，掺杂有机近红外二区荧光团 3TT 用于脑炎部位炎症的实时监测。RVG 是一种源自狂犬病病毒糖蛋白的肽，选择性地结合神经元 nAChR 受体，促进脑部靶向递送和有效的血脑屏障穿透。在脂多糖诱导的脑炎模型中，CeO₂ / 3TT@NP - RVG能够精确诊断不同程度的炎症，通过清除ROS减少氧化应激，抑制肿瘤坏死因子-α 和干扰素-β 等炎症细胞因子的释放，并减轻炎症。此外，CeO₂ / 3TT@NP - RVG 纳米材料促进细胞色素 P450 氧化还原酶的泛素化，从而抑制 ACSL4-LPCA3 通路，进而减少多不饱和脂肪酸合成，防止脂质过氧化，并减轻铁死亡。这些协同效应显著缓解了脑炎症状，提高了小鼠的生存率，并证明了这种纳米材料作为评估和治疗脑炎及相关神经系统疾病的创新策略的潜力。

图1. CeO₂/3TT@NP和CeO₂/3TT@NP-RVG纳米颗粒的合成与表征

根据先前报道的方法，合成具有广谱ROS清除活性的NIR-II荧光团(3TT)和前景良好的CeO₂纳米粒子。CeO₂ / 3TT@NP使用简单的一步法制备，即将 3TT、DSPE-PEG2000-TK-NHS和 CeO₂在室温下均匀混合于超纯水中，然后与 RVG 共轭连接（图1A）。在 808纳米激发下，CeO₂ / 3TT@NP - RVG 显示出明显的荧光发射（图1B），证明了其用于体内成像的潜力。粒径和 zeta 电位的表征显示， CeO₂纳米粒子的直径为 35.62 纳米，zeta 电位为 -36.67 mV，表明具有良好的稳定性。修饰后，CeO₂ / 3TT@NP和 CeO₂ / 3TT@NP - RVG纳米粒子的尺寸分别增加到 231.17 纳米和 283.20 纳米，zeta 电位逐渐降低，这归因于 DSPE-PEG2000-TK-NHS 和 RVG 的修饰（图1C）。

脑炎病变区域具有显著升高的ROS浓度，这是炎症的主要诱发因素。在构建刺激响应型纳米系统时，纳米粒子被巧妙地设计成可被ROS激活，从而实现对含有二硫酯键的 DSPE-PEG 链的精确切割，进而促进CeO₂的精细控制释放。如透射电子显微镜成像所示， CeO₂/ 3TT@NP - RVG 纳米粒子呈现出非常均匀的球形形态（图1D）。在暴露于过氧化氢后，这些纳米粒子经历逐渐聚集的过程，同时以时间控制的方式释放 CeO₂。这一现象通过元素图谱分析得到了进一步证实，为该释放机制提供了确凿的证据（图1E）。为了评估  CeO₂ / 3TT@NP - RVG 的细胞抗氧化能力，在三种细胞系（N2A 神经元细胞、BV2 小胶质细胞和293T 胚胎肾细胞）中，研究者首先使用 CCK-8测定评估了  CeO₂ / 3TT@NP - RVG 的细胞活力。在 0 - 100 μg/mL 的浓度范围内，在细胞系中未观察到明显的细胞毒性。共聚焦显微镜结果进一步证实， CeO₂ / 3TT@NP - RVG 显著降低了脂多糖处理的N2A 细胞中的ROS水平（图1F）。这些发现证实 CeO₂在神经元和胶质细胞中具有强大的抗氧化特性，与其在肿瘤细胞中的抗氧化作用报道一致。

图2. CeO₂/3TT@NP-RVG在脑炎小鼠的体内脑靶向及分布

为了评估 CeO₂ / 3TT@NP - RVG 的脑靶向能力，对六周龄雌性 BALB/c 小鼠颅内注射脂多糖以诱导脑炎，注射后 12 小时出现明显症状，随后通过尾静脉注射 CeO2/3TT@NP或  CeO2 / 3TT@NP - RVG。对照组小鼠接受颅内 PBS 注射，12 小时后尾静脉注射超纯水（图2A）。在注射后 2、8、16 和 24 小时通过体内成像监测脑部荧光信号。如图2B所示，在 PBS + 超纯水组的小脑中未检测到脑部荧光信号。相比之下，接受脂多糖 + CeO₂/3TT@NP或脂多糖 +  CeO₂ / 3TT@NP - RVG 的小鼠在注射后 2 小时就显示出脑部荧光信号，强度在 24 小时达到峰值。值得注意的是，脂多糖 +  CeO₂ /3TT@NP - RVG 组的脑部荧光显著强于脂多糖 + CeO₂/3TT@NP组，证实了 RVG 介导的脑靶向作用（图2B）。

为了评估生物分布，在注射后 24 小时处死小鼠进行离体器官荧光分析。与体内结果一致，脂多糖 +  CeO₂ / 3TT@NP - RVG 组显示出比脂多糖 + CeO₂/3TT@NP组更高的脑部荧光（图2B）。这两组之间心脏、脾脏、肺和肾脏的荧光强度相当，而在 PBS + 超纯水对照组中未检测到信号。CeO2 / 3TT@NP - RVG 组的肝脏荧光强度低于 CeO2/3TT@NP组，表明大多数 RVG 修饰的纳米粒子靶向脑部，导致在肝脏中代谢的纳米粒子减少。

为了评估纳米粒子在评估炎症方面的不同能力，对小鼠颅内注射不同剂量的脂多糖，然后尾静脉注射  CeO2 / 3TT@NP - RVG。在所有时间点，脑部荧光强度随脂多糖浓度的增加而比例增加，表明纳米粒子的富集程度与炎症严重程度相关。在 24 小时的离体脑部分析证实了这一趋势（图2E）。同时收集脑组织进行苏木精-伊红染色和炎症因子的 qPCR 分析（图2F-J）。结果显示，炎症随脂多糖浓度升高而逐渐加重，证实了脑荧光强度与炎症水平之间的正相关关系。

图3. CeO2/3TT@NP减轻脑炎并延长小鼠生存期

根据图3A所示的实验方案，将小鼠随机分为四组：对照组（颅内注射 PBS 12 小时后尾静脉注射水）、脂多糖组（颅内注射 10 μg 脂多糖 12 小时后尾静脉注射水）、 CeO₂ / 3TT@NP - RVG 组（颅内注射脂多糖 12小时后尾静脉注射  CeO₂/ 3TT@NP - RVG）和 CeO₂ /3TT@NP组（颅内注射脂多糖 12 小时后尾静脉注射  CeO₂ /3TT@NP。结果显示，脂多糖组的所有小鼠在第7天到第10天之间死亡，而接受  CeO₂ / 3TT@NP - RVG 治疗的小鼠生存期显著延长，仅在第15天死亡一只。相比之下， CeO₂ /3TT@NP组仅显示出轻微的生存期延长，大多数死亡发生在第7天到第11天之间（图3B）。苏木精-伊红染色显示，与对照组相比，颅内注射脂多糖诱导了大脑皮层和海马区的血管周围袖套现象和中性粒细胞浸润。这些病理变化通过静脉注射 CeO₂ / 3TT@NP - RVG 治疗显著减轻（图3C）。

研究者进一步使用 qPCR 分析了脑组织中促炎和抗炎细胞因子的 mRNA 水平。与对照组相比，脂多糖攻击显著提高了促炎因子水平，而  CeO₂ / 3TT@NP - RVG 治疗有效抑制了它们的表达（图3D-H）。同时，脂多糖降低了抗炎因子水平，而  CeO₂ / 3TT@NP - RVG 显著恢复了它们的表达水平（图3I 和 J）。颅内注射脂多糖可诱导小鼠脑炎，使用  CeO₂/ 3TT@NP - RVG治疗可显著抑制促炎细胞因子的 mRNA 水平，上调抗炎细胞因子的 mRNA 水平，并延长小鼠的生存时间。

图4. CeO₂/3TT@NP-RVG抑制大脑铁死亡

炎症通过增强免疫反应和ROS的产生来促进铁死亡。同时，铁死亡通过诱导氧化应激和破坏铁代谢进一步激活炎症。因此，ROS物种在此过程中起着至关重要的作用，因为它们既促进铁死亡，又加剧炎症的进展。在细胞水平上，研究者已经证明 CeO₂/ 3TT@NP - RVG 显著抑制神经元细胞中ROS的产生（图1F）。为了进一步验证 CeO₂ / 3TT@NP - RVG 对小鼠脑部ROS的调节作用，研究者按如下方式处理六周龄雌性 BALB/c 小鼠：对照组小鼠颅内注射 PBS 12 小时后尾静脉注射超纯水。实验组颅内注射脂多糖 12 小时后，分别尾静脉注射超纯水、 CeO₂/3TT@NP或 CeO₂ / 3TT@NP - RVG。72 小时后，研究者收集脑组织并用ROS探针染色。结果显示，在皮层和海马体这两个参与脂多糖诱导脑炎的主要区域，与注射脂多糖和超纯水的小鼠相比，注射 CeO₂ / 3TT@NP - RVG 的小鼠ROS水平显著降低（图4A 和 B）。

ROS的过度积累可导致脂质过氧化，从而触发铁死亡。为了研究 CeO₂/3TT@NP或  CeO₂ / 3TT@NP - RVG 是否通过调节ROS水平来调节铁死亡，研究者测量了铁死亡相关指标，包括 GPX4 蛋白水平、丙二醛（脂质过氧化的主要产物之一）、总体脂质过氧化水平和铁离子。结果显示，与对照组相比，脂多糖处理显著下调了 GPX4 蛋白水平，并上调了铁死亡相关指标，包括丙二醛、脂质过氧化和铁离子。相反，注射  CeO₂ / 3TT@NP - RVG 显著上调了 GPX4 蛋白水平，同时下调了丙二醛、脂质过氧化和铁离子水平（图4C、D、E 和 F）。上述结果表明  CeO₂ / 3TT@NP - RVG 可以通过降低ROS水平来抑制脑部的铁死亡。

图5.  CeO₂ / 3TT@NP - RVG 通过调节神经元 POR 通路减轻铁死亡

先前的研究表明，POR 促进ROS的产生，可能影响铁死亡相关酶（如 ACSL4 和 LPCA3）的表达和活性。ACSL4 负责激活多不饱和脂肪酸，而 LPCA3 将活化的多不饱和脂肪酸掺入磷脂中，驱动脂质过氧化并诱导铁死亡（图5A）。

为了研究 CeO₂的抗氧化作用是否涉及这一通路，用 1 μg/mL 脂多糖处理 N2A 细胞 12小时，然后用超纯水、 CeO₂/3TT@NP或  CeO₂ / 3TT@NP - RVG 处理 24 小时（图5B）。PBS 处理 6 小时随后用超纯水处理作为对照组。随后，进行 Western blot 分析以检测 POR、ACSL4 和 LPCA3 的蛋白水平。如图5C所示，与对照组相比，脂多糖处理增加了 POR、ACSL4 和 LPCA3 的蛋白水平。相反，与脂多糖处理组相比， CeO₂/3TT@NP和  CeO₂ / 3TT@NP - RVG 处理均显著降低了 POR、ACSL4 和 LPCA3 的蛋白水平。

为了研究 CeO₂ / 3TT@NP - RVG 调节 POR 蛋白水平的机制，研究者首先用 DMSO 或 1 μg/mL 放线菌素 D 处理 N2A 细胞 0、2、4、8 和 16 小时，然后收集细胞通过 Western blot 检测 POR 蛋白水平。结果显示，放线菌素 D 处理 8 小时后，POR 蛋白降解变得明显。接着，用  CeO2 / 3TT@NP - RVG 处理 N2A 细胞 24 小时，然后加入 1μg/mL 放线菌素 D 处理 0、2、4、8 和 16 小时，之后收集细胞进行POR 蛋白水平分析。结果显示，在放线菌素 D 处理 2 小时后， CeO₂ / 3TT@NP - RVG 显著加速了 POR 蛋白的降解，证明 CeO₂ / 3TT@NP - RVG 促进了 POR 蛋白降解（图5D）。为了研究 CeO₂ / 3TT@NP - RVG 加速 POR 蛋白降解的机制，研究者用  CeO₂ / 3TT@NP - RVG 或超纯水（对照组）处理 N2A 细胞 24 小时。之后，细胞用 DMSO、MG132（蛋白酶体抑制剂）、3MA（早期自噬抑制剂）或 CQ（晚期自噬抑制剂）处理 6 小时。通过 Western blotting 评估 POR 蛋白水平。结果表明，MG132 处理部分 rescued 了  CeO2 / 3TT@NP - RVG 诱导的 POR 蛋白下调，而 3MA 和 CQ处理没有显著影响（图5E）。

为了验证  CeO₂ / 3TT@NP - RVG 是否通过蛋白酶体途径调节 POR 蛋白水平，研究者用 pCDNA3.1-HA-ub 过表达载体转染 N2A 细胞。24 小时后，用 1 μg/mL 脂多糖处理细胞 12 小时，随后用超纯水、 CeO₂/3TT@NP或  CeO₂ / 3TT@NP - RVG 再处理 24 小时。PBS 处理 6 小时随后用超纯水处理作为对照。泛素化实验表明， CeO₂ / 3TT@NP - RVG 和 CeO₂/3TT@NP均显著增加了 POR 蛋白泛素化（图5F）。为了进一步确定哪种类型的泛素链介导了  CeO₂ / 3TT@NP - RVG 和 CeO2/3TT@NP对 POR 降解的调节，研究者在 N2A 细胞中过表达了 HA-ub(K48) 和 HA-ub(K63)。HA-ub(K48) 与蛋白质降解相关，而 HA-ub(K63) 参与蛋白质激活、转运和复合物形成。这些结果表明， CeO₂/ 3TT@NP - RVG 和 CeO₂/3TT@NP主要通过增加 POR 的 K48 泛素化来促进其降解，K63 链不参与其中（图5G 和 H）。

图6. CeO₂/3TT@NP-RVG通过调节神经元POR途径减轻铁死亡

RVG 通过结合突触后膜上的 nAChR 介导神经元靶向。为了验证其在脂多糖小鼠模型中穿过血脑屏障的机制，研究者预先给药了 nAChR 抑制剂 TMPH。结果显示，TMPH 显著减少了脑部荧光信号，抑制了脑部 Ce 的积累，并逆转了  CeO₂ / 3TT@NP - RVG 诱导的 POR-ACSL4-LPCA3 通路下调，表明RVG 通过其与 nAChR 的相互作用介导了 CeO₂/3TT@NP向脑内的递送以及随后的通路调节（图6A-C）。

为了进一步确定 CeO₂ / 3TT@NP - RVG 的靶细胞类型，研究者从小鼠分离了原代神经元、胶质细胞和内皮细胞，并用 TMPH、脂多糖、 CeO₂/3TT@NP或  CeO₂ / 3TT@NP - RVG 进行处理。结果显示，TMPH 在原代神经元中逆转了  CeO₂ / 3TT@NP - RVG 诱导的 POR-ACSL4-LPCA3 通路下调，而在胶质细胞或内皮细胞中未观察到这种效应（图6D）。

为了验证 CeO₂ / 3TT@NP - RVG 是否主要通过 POR 调节细胞内ROS，研究者构建了小鼠来源的 POR 过表达载体并将其转染到 N2a 细胞中，以空载体转染作为对照。转染 24 小时后，用脂多糖处理细胞，随后暴露于 CeO₂/3TT@NP或 CeO₂ / 3TT@NP - RVG。结果显示，POR 过表达逆转了  CeO2 / 3TT@NP - RVG 诱导的 ACSL4 和 LPCA3 蛋白水平上调（图6E）。此外，进一步的检测表明，POR 过表达恢复了由  CeO₂ / 3TT@NP - RVG 引起的丙二醛、脂质过氧化和ROS水平的降低（图6F-H）。这些发现表明 POR 是介导  CeO2 / 3TT@NP - RVG 作用的关键调节蛋白。

总之，研究者开发了  CeO₂ / 3TT@NP - RVG，一种用于诊断和治疗脑炎的多功能纳米材料。该平台结合了清除ROS的二氧化铈和具有光热特性的近红外二区发射 3TT 纳米粒子，能够实现神经炎症的深部组织荧光成像。RVG 肽的功能化确保了血脑屏障穿透和神经元靶向递送。在脂多糖诱导的脑炎模型中， CeO₂/ 3TT@NP - RVG 有效减少了氧化应激，抑制了促炎细胞因子，并通过下调POR-ACSL4-LPCA3 通路抑制铁死亡，提高了生存率并减轻了神经炎症。本研究开发的纳米平台将靶向神经元递送、ROS清除、铁死亡抑制和高对比度近红外二区成像整合到一个统一的系统中。除了治疗效果外，该平台还提供了对脑炎中脂质代谢驱动的铁死亡的机制见解，为机制引导的精准纳米医学奠定了基础。这些发现强调了该平台在治疗脑炎和其他中枢神经系统疾病方面具有前景的转化潜力，并为设计多功能纳米治疗药物提供了有价值的指导。然而，由于本研究是在主要反映炎症的急性脂多糖诱导脑炎模型中进行的，因此需要在病毒性脑炎模型中进行进一步验证，以确认 CeO₂ / 3TT@NP - RVG 的治疗效果和靶向性，并支持其临床转化。

参考文献

Wang, Qianruo, et al. "Inflammation-targeted nanoplatform: NIR-II imaging-guided encephalitis suppressing by dual antioxidant-ferroptosis action." Biomaterials (2025): 123741.

原文链接

https://doi.org/10.1016/j.biomaterials.2025.123741

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