本文要点：由808或980 nm激发的镧系离子激活纳米颗粒在生物成像领域展现出广阔的应用前景。本文揭示了这些纳米颗粒的物理化学特性，并探讨了它们作为近红外二区（NIR-II）荧光剂在生物成像中的潜力。具体而言，NIR-IIb窗口（1500-1700nm）具有低散射和组织自发荧光少的优点，这使得该区域适合进行更清晰的成像。镧系元素因其丰富的能级而具有多种发射可能性，使其成为高效的纳米探针。本研究聚焦于氧化钆（Gd2O3）作为主体材料，因其制备简便且毒性低。Gd2O3体系掺杂了Yb3+和Er3+离子，在NIR-IIx（1400−1500nm）和NIR-IIb窗口中实现了高达22.8%的量子效率。此外，穿透深度测试和体内成像研究揭示了NIR-IIb窗口的优越穿透性。此外，Gd3+离子具有磁性，这支持了其在磁共振成像（MRI）中的应用。本研究揭示了Yb3+-Er3+体系的高亮度和高能量转移效率，并探讨了Gd2O3纳米颗粒在MRI中的可行性。因此，这项工作为理解纳米荧光体在MRI/NIR-II成像中的动态变化提供了优越且具有生物相容性的候选材料，适用于临床应用。
极其灵敏且合适的荧光纳米探针是疾病早期诊断治疗的关键。结合多种成像方式可解决单一技术局限，提高诊断精度，确保更准确有效的临床结果。其中，多模态纳米粒子能以极高清晰度和精确度诊断疾病，受到生物医学领域关注。应用最广泛的纳米结构多模态成像探针将磁共振成像（MRI）与近红外二区（NIR-II）荧光成像相结合，其中，以稀土离子为特征、掺杂于无机晶体宿主基质中的稀土掺杂纳米粒子作为NIR-II荧光团引起了极大兴趣。与常见晶体氟化物宿主基质相比，Gd2O3作为宿主材料在高温下具有低水溶性和稳定性，是环保材料且在可见光到近红外区域没有额外荧光峰，能抑制组织自发荧光，显著提高信噪比。NIR-II光学探针提供高空间分辨率，MRI提供更精确的相对定位细节和生物学见解。基于钆（Gd）的纳米系统能限制光学和磁学性质，Gd2O3是有效的MRI造影剂和稀土发光材料的优良基质。相关研究证实了Gd2O3作为多模态探针基质的能力，但使用Gd2O3作为基质并探索Yb3+/Er3+能量转移途径以增强NIR-IIb发射的研究较少。
本研究通过光学研究探索了Yb3+到Er3+的能量传递途径，提高了Gd2O3:Yb3+,Er3+体系在近红外区域的内部量子效率，预期信噪比更高、穿透深度更广。APTES涂覆改善了纳米粒子分散性，该材料兼具MRI活性和NIR-IIb发射特性。体系表现出降频途径，与降频转换途径不同且后者实施有难度。APTES涂覆的纳米粒子可静脉注射到小鼠体内进行MRI/NIR-II成像以实现精准快速疾病诊断，该策略或可用于其他临床应用。
图1. Gd2O3:xYb3+,yEr3+纳米颗粒表征
采用柠檬酸溶胶-凝胶法合成Gd2O3:xYb3+,yEr3+（x=0.025，y=0.01）体系，随后在800°C的高温下进行烧结，如图1a所示。在合成Gd2O3:0.025Yb3+,0.01Er3+（GOYE）体系后，进行APTES涂层处理，以提高GOYE体系在水溶液中的分散性，用作生物成像剂。不同浓度Yb3+（1%、2.5%、5%、10%和15%）的X射线衍射（XRD）图谱显示为纯相，与JCPDS 12-0797的JCPDS图谱相匹配（图1b）。XRD图谱中未观察到额外杂质。图1b还展示了固定浓度Yb3+（2.5%）和不同浓度Er3+（0.1%、0.5%、1%、1.5%和2%）的XRD图谱。Gd2O3具有立方结构，空间群为Ia。观察到两个不同的Gd3+位点。第一个位点有Gd3+离子与六个O2-原子结合，并与八面体[GdO6]共享边。然而，在第二个位点，八面体[GdO6]位点发生了扭曲。氧原子位于Wyckoff位点24d（图1c）。Gd2O3的晶格参数a=b=c值为10.79 Å，晶胞体积为1256.21 Å3。图1d证实了APTES在GOYE纳米粒子周围均匀涂覆，涂层厚度为3-5纳米。此外，GOYE纳米粒子呈现出均匀的圆形结构。由于Gd2O3:0.025Yb3+，0.01Er3+（以下简称为GOYE）样品在掺杂剂浓度不同的样品中具有最高的近红外二区（NIR-II）发射强度，因此将其用于其他表征。
采用高斯-洛伦兹峰形和线性背景校正的X射线光电子能谱（XPS）分析证实了样品的化学组成和键合结构。结果验证了材料中存在Er3+和Yb3+离子。168 eV处的结合能峰归因于Er3+的4d价态，证实其已掺入样品中。同样，183 eV处的峰对应于Yb3+的4d价态，进一步证实了Yb3+的掺入。Gd2O3的形成也通过特征峰Gd 3d5/2和Gd 3d3/2在1186 eV和1218 eV的结合能得到证实。这些峰表明钆处于其预期的氧化态，并形成了Gd2O3结构的一部分。O 1s光谱提供了进一步证明键合成功的证据，该光谱显示528 eV处的主峰，与Gd2O3中Gd–O的键合特征一致。531 eV处的次峰也被鉴定为吸附的O2，表明样品内部存在表面相互作用。图1e中，XPS分析结果验证了Er3+和Yb3+的成功掺入。这些发现证实了现有离子的化学组成和氧化态。分析强调了钆和氧充分键合形成Gd2O3，同时表明铒和镱离子以+3氧化态成功掺入。GOYE纳米粒子上的APTES涂层通过傅里叶变换红外（FTIR）测量得到确认。在未涂覆的Gd2O3中，观察到约841 cm–1处的峰对应于Gd–O振动模式，证实了Gd2O3的存在。相比之下，APTES涂覆的Gd2O3在约1637 cm–1处出现了一个新的低强度峰，这可以归因于APTES层引入的−NH2变形。这一额外的峰证明了Gd2O3纳米颗粒系统上成功涂覆了APTES，并表明表面已有效改性为氨基硅烷化合物。这一详细的表征强调了合成的精确性和有效性，并确保了材料达到了预期的组成和结构。通过这一全面的分析，本研究建立了材料进一步应用和开发所需的化学和结构框架。
图2. 的近红外二区（NIR-II）成像实验
NIR-II成像设置如图2a所示，其中使用808和980 nm激光激发NIR-II探针（GOYE和GOYE@APTES)。使用InGaAs相机通过1100nm长通（LP）滤光片捕获样品的NIR-II图像。图2b显示了放置在含有GOYE和GOYE@APTES样品。NIR-II探针在乳腺组织内的穿透深度约为1cm。图2c表示NIR-II信号强度与穿透深度之间关系的定量评估，其中NIR-II的信号强度随着鸡胸脯组织厚度的增加而降低，并在9mm组织厚度之前显示最大强度。图2d也显示NIR-II信号强度在5mm组织厚度内保持明亮。GOYE@APTES由于APTES涂层的影响，与GOYE相比，NIR-II信号的强度差异很小，但并不那么突出。NIR-II信号强度与穿透深度关系的比较GOYE@APTES在λex=808nm和λex=980nm激发下的样品，当λex=980 nm时，由于在该波长下水的吸收，NIR-II信号强度突然降低。然而，对于λex=808 nm，下降更为平缓。因此，它证实了λex=808 nm比λex=980 nm提供了更好的穿透深度（图2e）。NIR-II信号从0逐渐减小到11mm。图像表明，对于λex=808nm的组织厚度，NIR-II的信号可以在近9mm处观察到，对于λex=980nm的组织厚度可以在5mm处观察到。这证实了GOYE@APTES在λex = 808 nm时具有较高的穿透深度。
图3. GOYE和GOYE@APTES样品生物相容性分析
图3a、b展示了用GOYE和GOYE@APTES处理的NeHepLxHT（正常肝细胞）和Mahlavu（癌细胞）的细胞活力图。选择肝细胞进行体外研究，因为纳米颗粒在静脉注射后倾向于在肝脏中积聚。使用连续稀释技术配制了五种不同浓度（0.25、0.125、0.0625、0.03125和0.015625 mg/mL）来处理细胞72小时。GOYE和GOYE@APTES两种样品对NeHepLxHT细胞显示出相似的细胞活力趋势，其中镧系样品浓度的增加分别将细胞活力降低至73%和64%。两种样品在NeHepLxHT和Mahlavu细胞中获得的最高细胞活力均大于80%。两种镧系样品对NeHepLxHT正常肝细胞和Mahlavu癌细胞的细胞毒性较小。*P值是针对GOYE@APTES样品计算的。图3c展示了用PBS连续稀释浓度为250、125、62.5、31.3和15.65 μg/mL后，GOYE和GOYE@APTES样品的溶血测试结果。为计算溶血率，使用了公式5：
其中As是样品在540 nm处的吸光度，A0是阴性对照在540 nm处的吸光度，A∞是阳性对照在540 nm处的吸光度。GOYE样品在125μg/mL血液浓度下显示出其最高溶血率，为6.65 ± 0.1%。相比之下，GOYE@APTES系统的最高溶血率明显较低，在15.65 μg/mL血液浓度下记录为0.66± 0.01%。此外，GOYE@APTES的溶血率在较低浓度下远低于4%，与未包覆的GOYE系统相比显著降低。APTES包覆在增强GOYE的生物相容性、限制其溶血活性并降低红细胞损伤潜力方面起到了关键作用。图3d展示了静脉注射10 mg/mL GOYE@APTES后裸鼠器官的苏木精和伊红染色结果。经GOYE@APTES样品处理后，脑、脾、肝、心、肺和肾组织未显示任何组织学变化。
图4. MRI分析
图4a展示了GOYE和GOYE@APTES图像的T1和T2映射图，并证实了样品中MRI信号的存在。GOYE和GOYE@APTES样品的浓度分别为17.2、8.6、4.3、2.15和1.075 mM。拟合曲线的斜率对应于纵向（r1）和横向（r2）弛豫率。GOYE的T1和T2弛豫率分别为0.0009和0.3262 mM–1·s–1。r1值较低可能是由于GOYE纳米颗粒浓度较低和尺寸较小所致。较高的r2值表明GOYE系统可用作T2造影剂，而非公认的T1造影剂。拟合曲线的斜率对应于T1和T2弛豫率。GOYE@APTES的r1和r2分别为0.0048和0.8558 mM–1·s–1。该结果与未包覆的GOYE纳米颗粒相似。较高的r2值可能源于Gd2O3纳米颗粒较大的平均尺寸。随着Gd2O3纳米颗粒平均尺寸的增加，导致r2/r1比值升高。在图4b中，GOYE和GOYE@APTES的r2/r1值均超过150，这证实了纳米探针可能用作T2造影剂，使器官图像显得更暗；这一现象是由于GOYE@APTES纳米探针尺寸较大（约140 nm，图S12a）以及纳米探针的形状所致。 本研究中，通过尾静脉向小鼠注射了200 μL GOYE@APTES。扫描区域以肝脏为中心，并在注射后10分钟进行成像。图4c、d分别显示了T1加权和T2加权MRI扫描结果。NOD-SCID小鼠静脉注射GOYE@APTES并被摄取后，T1加权图像显示肝脏亮度增加，同时肾脏的髓质和肾盂清晰可见。在T2加权图像中，注射后肾盂与肾椎体之间的对比度增强。
图5. λex = 808/980 nm激光下NIR-II体内成像的比较
图5a展示了用于体内小鼠近红外二区成像的实验装置示意图，其中使用InGaAs近红外二区相机配合1300 nm长通滤光片进行图像采集。图5b显示静脉注射GOYE@APTES（10 mg/mL）后裸鼠体内的近红外二区b波段图像。未注射GOYE@APTES的对照组小鼠未显示任何近红外二区b波段强度。图5b展示了在λex = 808 nm和980 nm激发下调整至更清晰曝光时间的图像，通过观察两幅图像的亮度可显示浅表组织显影情况。近红外二区信号强度的定量测量中980 nm激光激发相较于808 nm激光激发显示出更高的近红外二区信号强度和亮度。图5c验证了静脉注射GOYE@APTES（10 mg/mL PBS）后裸鼠的器官成像结果，曝光时间为4000 ms，λex = 808 nm。小鼠的肝脏、大肠和膀胱清晰可见。肝脏感兴趣区域的信背比为2.6，半高宽为12 mm（图5d）。图5e同样显示在980 nm激光激发下，静脉注射相同浓度、相同曝光时间的裸鼠近红外二区b波段信号强度，仅小鼠肝脏可见。肝脏感兴趣区域的信背比为3.3，半高宽为21 mm（图5f）。808 nm和980 nm激光激发各有优缺点。尽管980 nm激光激发的信背比更高，但其半高宽相较于808 nm激光激发和近红外二区b波段强度更宽。此外，808 nm激光激发显示出了更深层次的器官（如大肠），且半高宽较窄，验证了图2中鸡肉穿透深度的结果。这证明了808 nm激光激发用于生物成像目的的重要性。
参考文献
Satpathy, Aishwarya, et al. "Gd2O3 Doped with Yb3+/Er3+for Boosted Downshifting Pathway in NIR-IIb Region and Exploring the Dynamics of MRI/NIR-II Imaging in the Nanophosphor." ACS Applied Materials & Interfaces 17.44 (2025): 60789-60801.
原文链接
https://doi.org/10.1021/acsami.5c14860
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