本文要点：脑侧支循环与血脑屏障（BBB）对维持正常脑功能至关重要，受限于现有方法对脑血流微小通路的记录能力，学界对生理和病理状态下侧支灌注与血脑屏障动态演变的认知仍显不足。本文报道了一种由小分子染料与牛血清白蛋白构成的高结晶度半导体有机纳米探针（命名为4T-BSA），其在第二近红外窗口（NIR-II，1000-1700 nm）展现出显著的活体脑血管成像潜力。该探针在完整小鼠脑中具有卓越的成像穿透深度，信背比（SBR）达6.0，并能在三种典型神经病理生理模型中实现低至50微米级的脑血管空间分辨率。通过可视化血管侧支灌注与白蛋白渗漏，4T-BSA纳米探针精准识别了与动/静脉侧支血流网络及血脑屏障破坏相关的脑病理活动。本项研究，基于NIR-II成像的脑侧支循环与血脑屏障损伤评估技术，将为神经系统疾病及时干预、神经保护及功能修复等重大医学挑战提供广阔解决方案。
本研究开发了一种高结晶度半导体有机NIR-II纳米探针（命名为4T-BSA）。该探针通过修饰CH1055分子的功能基团后，与牛血清白蛋白（BSA）非共价组装形成新型分子复合物。研究团队在1350 nm窄波段（NIR-IIa区）开展了系统的体外与活体成像实验，并与传统光学及磁共振成像技术进行对比。实验对象涵盖脑动脉闭塞（MCAO）、脑静脉窦血栓（CVST）及戊四氮点燃癫痫等典型神经病理生理模型。多维度证据表明，4T-BSA纳米探针能够高保真记录生理状态下深部脑血管血流动力学特征及动静脉侧支循环响应（图1a–c）。尤为重要的是，得益于对血清白蛋白的高亲和力，该探针可在病理条件下（特别是血脑屏障早期渗漏阶段）实现无创、精准、实时的血脑屏障微渗漏动态追踪（图1d,e）。
图2. 4T-BSA纳米探针的结构和光学特性
将CH1055的四个羧酸基团全部替换为更具负电荷的磺酸基团（命名为4T），然后与牛血清白蛋白（BSA）组装形成4T-BSA纳米探针（图2a）。4T和4T-BSA纳米探针的紫外-可见（UV–vis）光谱在320-1000 nm范围内显示出相似的吸收信号。如图2b所示4T和BSA的自组装在近红外二区（NIR-II）成像系统下导致荧光强度显著增加（图2b插图）。4T-BSA纳米探针在≈990 nm处有最大荧光发射峰，在808 nm激发下，其发射强度比4T高出110倍以上。在808 nm激发下，4T-BSA在990 nm处的量子产率计算为5.3%。透射电子显微镜（TEM）图像及其对应的粒径分布直方图（图2c）清楚地表明，4T-BSA纳米探针具有胶体稳定性，呈球形，平均直径为5.5±0.6 nm。通过高分辨率透射电子显微镜（HR-TEM）仔细测量，在4T-BSA纳米探针中可以直接观察到发育良好的晶格边缘，其晶面间距约为0.25 nm（图2d）。元素分布的映射表明存在富含硫的黄色区域，表明小分子4T自组装到BSA的内部。原子力显微镜（AFM）证实，4T-BSA纳米探针在水中表现出优异的单分散性，主要直径位于3-7 nm范围内（图2f），与TEM分析一致。通过选择从1150到1400 nm的连续长通滤波器，发现脑血管在长达1350 nm的更长波长窗口处比在较短波长窗口处更清晰，之后深层血管的信号开始减弱（图2g）。对脑血管横截面强度轮廓的进一步量化信噪比（SBR）测量表明，在808 nm激发下，NIR-II成像的最大分辨率在1350 nm长通滤波器（NIR-IIa窗口）（图2h）。在之后的部分中，除非另有说明，否则成像在NIR-IIa窗口中进行。
图3. 利用4T-BSA纳米探针在不同小鼠模型中对脑血管进行高分辨率NIR-IIa荧光活体成像
为了探究近红外二区（NIR-II）成像观察脑循环系统病理生理过程的可行性，分别将4T-BSA和吲哚青绿（ICG）-BSA纳米探针以等效剂量（35 nM）通过静脉注射到三种典型的神经病理生理学小鼠模型中（每组3只）。在808 nm激光照射下，通过完整的头皮和头骨，在狭窄的1350-1650 nm成像区域内，对小鼠脑的脑血管系统进行了大视场成像记录。与ICG-BSA纳米探针在NIR-I（<900 nm）区域中无法区分的血管和较低的信噪比（SBR）。形成鲜明对比的是，4T-BSA纳米探针在NIR-IIa窗口中的脑血管荧光成像明显显示出更高的空间分辨率，无论是在哪种神经病理生理学小鼠模型中。在假NIR-IIa组（图3a、d）中，通过4T-BSA纳米探针拍摄的脑血管造影清晰地显示了大脑中动脉（MCA）、下脑静脉、上矢状窦（SSS）、横窦、窦汇，以及头皮和头骨下的双侧大脑半球中的大量皮质血管和脑微血管。4T-BSA纳米探针在NIR-IIa区域中SSS的信噪比（图3d）计算为6.0±0.1，这明显高于ICG-BSA在NIR-I窗口中的信噪比（1.7±0.2；P<0.01）。在NIR-IIa区域中成像的SSS的高斯拟合半高全宽（FWHM）估计为702±3.9 µm（图3g），而通过ICG-BSA纳米探针成像的SSS的FWHM增加到1105±8.2 µm。此外，左右大脑中动脉区域选定血管的FWHM分别为206±2.3和149±4.1 µm。
在大脑中动脉闭塞（MCAO）的NIR-IIa组中，4T-BSA纳米探针的NIR-II荧光信号在对侧大脑半球的右侧大脑中动脉（MCA）区域可以明显观察到（图3b、e），而在左侧（同侧）半球几乎没有信号（用白色虚线圈标出）。右侧MCA区域选定血管的横截面强度轮廓的半高全宽（FWHM）被确定为197±7.1 µm，而在左侧的镜像动脉上无法实现这一测量（图3h），这表明MCA区域存在低灌注。同样，在脑静脉窦血栓形成（CVST）的NIR-IIa组中，4T-BSA纳米探针可以照亮双侧大脑中动脉区域（图3f）。左侧MCA区域选定血管的FWHM为129±5.2 µm，信噪比（SBR）高达5.2±0.1（图3i），而在上矢状窦（SSS）区域几乎没有监测到荧光信号。因此，NIR-IIa成像能够准确定位CVST模型中的血栓位置。
图4. 4T-BSA纳米探针NIR-IIa活体成像定量分析不同神经病理生理模型小鼠血流动力学脑灌注
为了研究局部脑血流，研究人员分别通过尾静脉注射将35 nM的4T-BSA纳米探针注入假手术（sham）、大脑中动脉闭塞（MCAO）和脑静脉窦血栓形成（CVST）模型的C57BL/6小鼠体内。通过时间序列的NIR-IIa成像（1350 nm长通滤波器、808 nm激发，成像速率为每秒1帧）记录信号波动，以研究无需开颅情况下脑部视野内的信号变化。在假手术NIR-IIa组中，NIR-II荧光强度随注射后时间的延长而迅速增加。如预期所示，左侧大脑中动脉（MCA）区域的NIR-IIa信号强度几乎与相应的右侧区域相等，表明双侧MCA区域的灌注率相同。在MCAO组中，4T-BSA纳米探针的荧光信号（图4b中绿色虚线圈标出）在注射后1秒内立即出现在右侧MCA（对侧）区域。值得注意的是，右侧MCA的荧光信号迅速增加，并在注射后约40秒达到平稳，而左侧MCA（同侧）区域几乎没有NIR-IIa信号出现（图4b中黄色虚线圈标出）。动态荧光信号波动分析表明，大脑左侧MCA区域的血流灌注显著减少。例如，右侧MCA区域的脑血流灌注率比相应的左侧缺血MCA区域高出约五倍。此外，在假手术组中，矢状窦（SSS）的前后区域的NIR-IIa信号没有明显差异。令人印象深刻的是，在CVST组中，4T-BSA纳米探针注射后，SSS前区域（图4c中黄色虚线圈）的NIR-IIa荧光信号可以立即观察到。同时，SSS后区域（图4c中绿色虚线圈）的NIR-IIa信号几乎可以忽略不计，这代表了血栓形成的部位。如图4g总结所示，SSS前区域的脑血流灌注率比后区域高出约四倍，表明由于SSS后区域的窦血栓（阻塞）导致静脉回流障碍。
图5. 在体实时记录脑内动脉或静脉侧支循环网络的演变
研究人员探讨了4T-BSA纳米探针在大型颅内血管（大脑中动脉或矢状窦）近端阻塞时，准确测量脑部微血管动静脉侧支循环的潜力。将整个小鼠头部放置在激光下的成像平台上，然后在通过尾静脉向MCAO和CVST模型的C57BL/6小鼠体内注射35 nM的4T-BSA纳米探针后，连续记录90分钟。
在MCAO组中，在低倍率（2.5×）下实时捕捉整个小鼠头部的动态图像，可用于观察整个小鼠头部（图5a）。值得注意的是，NIR-IIa动态图像（40分钟）中的蓝色箭头代表一种血管畸形，这由4T-BSA纳米探针在脑血管中的明亮发射强度证实。在放大左侧大脑中动脉区域后，通过NIR-IIa动态成像的高倍率（10×）监测感兴趣区域（图5a中的蓝色虚线矩形），以明确血流低灌注的细节。如图所示，在注射4T-BSA纳米探针后约15分钟，明确观察到单一毛细血管的血流灌注（图5b中的白色箭头）。图5b中蓝色虚线穿过血流灌注区域的横截面强度轮廓证实了在注射4T-BSA纳米探针后约15分钟新生血管的出现（图5d）。这些新生血管的特征是尖锐的峰值，半高全宽（FWHM）约为42微米。NIR-IIa血流灌注成像表明皮质动脉侧支循环的开通，这可以支持大脑组织在阻塞的左侧大脑中动脉区域的存活（图5c）。同时，4T-BSA纳米探针的流动可用于评估与动脉侧支循环相关的血流灌注动态（图5e）。基于MCAO模型大脑中动脉侧支循环血流网络演变的上述血流灌注研究发现，内在动脉侧支循环的最大开通至少维持了65分钟（图5e），从而在急性缺血性疾病期间确保足够的血流以支持大脑的存活。
在CVST模型中，可以轻松测量静脉窦阻塞部位周围的脑静脉侧支循环灌注（图5f）。仔细观察在注射4T-BSA纳米探针后30分钟内的连续放大NIR-IIa图像，清楚地检测到在阻塞的静脉窦区域上方有许多复杂侧支吻合发育（图5g）。此外，发现多个侧支连接从血栓周围的脑血管（矢状窦的中后区域）移动到矢状窦的前区域（图5g中的白色和蓝色箭头）。综合来看，4T-BSA纳米探针的NIR-IIa成像可以阐明侧支血流灌注的高分辨率连续实时监测。对相同血管和吻合区域的横截面强度轮廓进行定量分析，进一步证实了阻塞静脉窦区域周围的脑静脉侧支循环灌注（图5h）。
本文建立了三种典型的神经病理生理学小鼠模型，即大脑中动脉闭塞（MCAO）、脑静脉窦血栓形成（CVST）和癫痫，以准确模拟不同的BBB破坏行为（图6a）。除了使用4T-BSA纳米探针进行NIR-IIa成像外，还进行了详细的近红外一区（NIR-I）、磁共振成像（MRI）和Evans蓝（EB）标记白蛋白脑成像，以表征BBB特性的相对变化。
在再灌注后2到72小时内，MCAO模型小鼠中发现了显著的荧光信号（图6b中的蓝色箭头），表明与对侧相比，缺血半球中4T-BSA纳米探针的外渗和积累更多。4T-BSA纳米探针的泄漏信号强度和面积随时间缓慢增加和扩展（图6g）。值得注意的是，在再灌注后72小时从小鼠头骨中取出整个大脑进行离体NIR-IIa成像，可以在缺血MCA区域保持强烈的荧光信号（图6g中的灰色曲线），表明4T-BSA纳米探针明显外渗（图6c，左）。同时，对约20微米厚的大脑冠状切片进行NIR-IIa显微成像证实了BBB破坏行为（图6d），这由MCAO区域缺血半球中4T-BSA纳米探针的明显外渗证明。在离体EB组（图6e）中，这是脑切片中BBB泄漏的标准离体标记，EB外渗显示出与MCAO模型中缺血MCAO区域的4T-BSA纳米探针相似的空间分布，但剂量约为后者的35.7倍（1.25微米）且切片厚度大50倍（1毫米）（4T-BSA纳米探针为35纳米，20微米）。在这方面，4T-BSA纳米探针可能有助于有效阐明病理条件下BBB的演变。
为了评估脑实质中血浆白蛋白的外渗，通过时间序列分析沿图6b中蓝色虚线的横截面强度轮廓，测量了缺血MCAO区域上积累的4T-BSA纳米探针信号。NIR-IIa信号在注射后8小时扩散到整个MCAO区域，并在16小时后超过MCAO区域的核心部分（图6g）。这一发现表明，水肿形成的区域似乎先于MCAO区域，并伴随着血浆成分的外渗（图6c，左）。
此外，对于CVST NIR-IIa组，在通过尾静脉注射4T-BSA纳米探针（35 nM）后，进行了额外的脑静脉缺血实验，并监测了从1到45分钟的时间序列NIR-IIa图像。如图6h所示，更高倍率（5×）的动态体内NIR-IIa图像显示在注射后10分钟4T-BSA纳米探针的泄漏。值得注意的是，在注射4T-BSA纳米探针后16小时对CVST小鼠大脑进行的体内成像显示，NIR-IIa信号以及观察到的BBB破坏保留在缺血SSS区域（图6i，左）。此外，CVST小鼠大脑的离体成像确定了SSS周围4T-BSA纳米探针的外渗（图6j），与CVST小鼠（再灌注后16小时）通过静脉注射EB染料进行的大脑离体成像非常相似（图6k）。
在注射4T-BSA纳米探针后2小时，观察到双侧顶颞叶皮层和海马周围区域的强烈泄漏（图6m）。有趣的是，在注射4T-BSA纳米探针后16小时，归因于BBB泄漏的NIR-IIa强度几乎可以忽略不计（图6m,n），暗示单次癫痫发作的可逆BBB破坏行为。使用EB染料的离体实验证实了海马和中脑周围的BBB泄漏，而在顶颞叶皮层上有淡淡的蓝色染色（图6o）。
尽管越来越多的证据表明血脑屏障（BBB）通透性变化在常见神经疾病发病机制中的作用，但目前缺乏在生理和病理条件下研究微小脑血管BBB特性的高保真方法。为此，本文建立了三种典型的神经病理生理学小鼠模型，即大脑中动脉闭塞（MCAO）、脑静脉窦血栓形成（CVST）和癫痫，这些模型可以准确模拟不同的BBB破坏行为（图6a）。除了使用4T-BSA纳米探针进行NIR-IIa成像外，还仔细进行了其他典型的近红外一区（NIR-I）、磁共振成像（MRI）和 Evans蓝（EB）标记白蛋白脑成像，以表征BBB特性的相对变化。
为了在MCAO组中实现动态体内NIR-IIa脑成像，将整个小鼠头部安装在激光下的成像位移台上。在4T-BSA纳米探针注射后，立即在狭窄的1350–1650 nm成像区域内进行无创NIR-IIa成像。在再灌注后2到72小时内，MCAO模型小鼠中发现了显著的荧光信号（图6b中的蓝色箭头），表明与对侧相比，缺血半球中4T-BSA纳米探针的外渗和积累更多。此外，对缺血MCAO区域的信号进行时间序列分析显示，4T-BSA纳米探针的泄漏信号强度和面积随时间缓慢增加和扩展（图6g；图S10，支持信息）。值得注意的是，在再灌注后72小时从小鼠头骨中取出整个大脑进行离体NIR-IIa成像，可以在缺血MCA区域保持强烈的荧光信号（图6g中的灰色曲线），表明4T-BSA纳米探针明显外渗（图6c，左）。同时，对约20微米厚的大脑冠状切片进行NIR-IIa显微成像证实了BBB破坏行为（图6d），这由MCAO区域缺血半球中4T-BSA纳米探针的明显外渗证明。在离体EB组（图6e）中，这是脑切片中BBB泄漏的标准离体标记，EB外渗显示出与MCAO模型中缺血MCAO区域的4T-BSA纳米探针相似的空间分布，但剂量约为后者的35.7倍（1.25微米）且切片厚度大50倍（1毫米）（4T-BSA纳米探针为35纳米，20微米）。在这方面，4T-BSA纳米探针可能有助于有效阐明病理条件下BBB的演变。
为了评估脑实质中血浆白蛋白的外渗，通过时间序列分析沿图6b中蓝色虚线的横截面强度轮廓，测量了缺血MCAO区域上积累的4T-BSA纳米探针信号。被困的NIR-IIa信号将在注射后8小时扩散到整个MCAO区域，并在16小时后超过MCAO区域的核心部分（图6g）。这一发现表明，水肿形成的区域似乎先于MCAO区域，并伴随着血浆成分的外渗（图6c，左）。
此外，对于CVST NIR-IIa组，在通过尾静脉注射4T-BSA纳米探针（35 nM）后，进行了额外的脑静脉缺血实验，并监测了从1到45分钟的时间序列NIR-IIa图像。如图6h所示，更高倍率（5×）的动态体内NIR-IIa图像显示在注射后10分钟4T-BSA纳米探针的泄漏。在45分钟的测量时间窗口内，每5分钟成功追踪一次靠近上矢状窦的脑实质中4T-BSA纳米探针的积累。值得注意的是，在注射4T-BSA纳米探针后16小时对CVST小鼠大脑进行的体内成像显示，NIR-IIa信号以及观察到的BBB破坏保留在缺血SSS区域（图6i，左）。此外，CVST小鼠大脑的离体成像确定了SSS周围4T-BSA纳米探针的外渗（图6j），与CVST小鼠（再灌注后16小时）通过静脉注射EB染料进行的大脑离体成像非常相似（图6k）。
为了进一步研究4T-BSA纳米探针检测BBB通透性的灵敏度和穿透深度，通过记录单次腹腔注射戊四氮后的潜伏期和强度1小时，建立了戊四氮诱发的癫痫小鼠模型，然后通过尾静脉注射4T-BSA纳米探针（35纳米）以观察BBB的完整性。在NIR-IIa成像窗口下，可以在戊四氮诱发的癫痫发作的大脑中发现典型的BBB破坏模式，这由多个区域的4T-BSA纳米探针外渗证明。例如，在注射4T-BSA纳米探针后2小时，观察到双侧顶颞叶皮层和海马周围区域的强烈泄漏（图6m）。有趣的是，在注射4T-BSA纳米探针后16小时，归因于BBB泄漏的NIR-IIa强度几乎可以忽略不计（图6m,n），暗示单次癫痫发作的可逆BBB破坏行为。使用EB染料的离体实验证实了海马和中脑周围的BBB泄漏，而在顶颞叶皮层上有淡淡的蓝色染色（图6o）。上述成像数据表明，4T-BSA纳米探针允许对完整小鼠大脑中的细微BBB通透性进行无创体内监测，具有高清晰度和深穿透性。
作为比较，在NIR-I组中，分别将ICG-BSA纳米探针（35 nM）通过尾静脉注射到三种典型的神经病理生理学模型中。在MCAO、CVST和癫痫小鼠模型的缺血区域周围未监测到体内显著变化（图6c,i的右侧面板；图S11，支持信息）。例如，在MCAO小鼠模型中，ICG-BSA纳米探针的发射波长较短，无法在再灌注后72小时从头骨中取出的大脑进行高质量的离体NIR-I成像（图6c，右侧面板）。对于MRI对照组，在静脉注射Gd-DTPA放射性示踪剂后立即进行对比后T1加权成像，这归因于其非常短的血浆半衰期。值得注意的是，无论是在MCAO、CVST还是癫痫神经小鼠模型中，对比增强成像只能在缺血区域的边缘检测到（图6f,l,p）。上述成像方式的联合支持了一个令人信服的结果，即4T-BSA纳米探针在NIR-IIa成像窗口中显示出高保真和持续记录BBB通透性的巨大潜力。
4T-BSA纳米探针解析了通过完整头皮和头骨对整个小鼠大脑进行大视场成像的血流动力学。使用4T-BSA纳米探针的NIR-IIa成像清晰地证明了不同神经病理生理学模型的成功建立。MCAO模型可以评估4T-BSA纳米探针动态穿透受损血脑屏障（BBB）并靶向缺血驱动生物标志物的能力。CVST模型用于强调4T-BSA纳米探针在低流量静脉系统中血栓成像的特异性，突出其区分动脉与静脉血栓的潜力。癫痫模型旨在验证4T-BSA纳米探针对早期微血管异常检测的敏感性。4T-BSA纳米探针可以通过分析动态荧光信号波动定量研究血流动力学脑灌注率。
参考文献
Chen S, Chen H, Li X, et al. Dynamic Pathophysiological Insight into the Brain by NIR‐II Imaging[J]. Advanced Science, 2025: 2416390.
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