本文要点：近红外II区（NIR-II，900–1880 nm）荧光共聚焦显微镜具有高空间分辨率和广泛的活体成像能力。然而，传统共聚焦显微镜需要精确的针孔定位，由于针孔尺寸微小且NIR-II荧光不可见，这带来了挑战。为简化系统，本研究采用光纤波长分割多路复用器（WDM）替代传统的二向色镜和针孔，用于激发光和荧光光束的耦合，使NIR-IIb（1500–1700 nm）荧光与激发光通过同一根光纤传输。这一简化系统通过光纤无缝集成了关键组件——激发光源、探测器和扫描显微装置。与传统NIR-II共聚焦系统相比，光纤WDM配置更简洁且易于调节。值得注意的是，该系统成功实现了小鼠脑血管的断层成像，深度达1000 μm，并能在800 μm深度区分直径4.57 μm的微小血管（信背比SBR=5.34）。此外，系统还能清晰成像通常难以观测的肝脏血管，深度达300 μm。

图1. 基于WDM的简化NIR-IIb荧光共聚焦显微系统

图1a展示了基于光纤WDM的简化共聚焦显微系统。980 nm激光通过WDM的蓝端口输入，经反射准直器输出准直光，通过振镜扫描系统聚焦于样品。1550 nm荧光反向传输至WDM公共端口，经四级级联WDM滤除激发光后，由SNSPD检测（图1b-e）。光纤核心（9 μm）和准直器协同替代针孔，简化了系统调节，并保留了传统共聚焦的光学断层能力。

图2. 量子点PbS/CdS QDs的表征

选用PbS/CdS量子点作为荧光探针，其荧光发射峰位于1601 nm（图2c），满足WDM的980/1550 nm波段需求。透射电镜（TEM）显示量子点尺寸均匀<10 nm，动态光散射（DLS）表明PEG修饰后水合粒径为32.7 nm（图2b）。量子点在高激发功率下表现出强荧光（图2d-e），且生物相容性良好。

图3. 体内宏观成像和显微成像

为了验证使用980 nm激发光在NIR IIb波段内PbS/CdS量子点的有效体内成像能力，首先在尾静脉注射200µL 1 mg mL^-1量子点后，对小鼠的整个身体和腿部进行宏观成像（图3a，b）。功率密度为20mW/cm²，积分时间为150ms，SBR为2.4，可以清楚地区分腿部的小血管。

随后，利用PbS/CdS量子点对小鼠脑血管系统进行宽视场显微成像。首先，对小鼠进行开颅手术，小心地切除脑膜，然后用一块圆形玻璃密封颅窗。在尾静脉注射200µL 6 mg mL^-1 QDs后，在NIR IIb波段内对小鼠脑血管进行广角显微成像，在脑表面使用35 mW的功率和100 ms的积分时间。广角显微成像（图3c1-c8）没有针孔，缺乏光学切片能力。在深层组织成像中，表层的荧光充当深层的背景，导致背景强度升高，随后SBR降低。实现的最大成像深度为700µm，在这个深度，SBR的测量值仅为1.12（图3d）。

图4. 不同深度脑血管的NIR IIb共聚焦显微图像和三维重建

在取出颅骨和脑膜，并用玻璃密封颅窗后，将200µL 6 mg mL^-1的QDs注射到尾静脉中。采用每像素10µs的扫描速度，利用4µm步进移动物镜进行轴向扫描，对小鼠大脑的单层深度进行扫描。扫描区域设置为512×512像素。在之前报道的与NIR-II共聚焦成像相关的工作中，扫描速度通常需要每像素至少10µs，有些甚至需要每像素≈190µs。此外，大脑表面的激发功率需要至少为10mW甚至更高。在这项研究中，尽管WDM的带宽很窄（≈70 nm），导致仅收集了≈28.9%的荧光，并且由于直径为9µm的针孔，荧光收集效率进一步降低，但凭借高亮度的PbS/CdS量子点和高效的SNSPD，该系统仍然能够以相对较快的成像速度（每像素10µs）和较低的脑表面功率（仅6 mW）对1000µm以上的小鼠脑血管进行高质量的共聚焦显微成像。值得注意的是，共聚焦显微镜的整体背景强度仍然很低，700µm的SBR为39.81，1000µm为5.34，超过了广角显微镜的性能。此外，该成像系统具有高空间分辨率，成功区分了直径为4.97µm的小血管，深度为350µm，直径为4.57µm，深度为800µm（图4b，c）。由于针孔直径极小（9µm），对离焦区域产生的荧光有更好的过滤效果，从而降低了背景信号。与之前报道的作品相比，这导致了更高的SBR和更好的成像质量。使用来自不同深度的图像，重建了小鼠脑血管的三维（3D）结构（图4d）。

图5. 不同深度肝脏的NIR IIb共聚焦显微图像

肝血管成像在区分以血供丰富和血流减少为特征的占位性病变以及诊断肝血管瘤等特定肝脏疾病方面具有宝贵的诊断潜力。然而，由于肝脏组织的结构比大脑更密集，散射系数更大，肝脏的成像深度往往受到限制。在目前报道的多光子荧光成像相关研究中，肝脏致密结构的最大可实现成像深度可达250µm。在这项研究中，应用NIR IIb共聚焦显微镜来观察小鼠的肝血管。在尾静脉注射200µL 6 mg mL⁻¹ PbS/CdS量子点，两小时后，小心切开小鼠腹部，轻轻抬高肝脏并将其放置在载玻片上，盖上盖玻片以创建一个专门的成像窗口。肝血管成像（图5）是在与脑血管成像相同的激发功率和扫描速度下进行的。扫描区域设置为1024×1024像素。值得注意的是，这种方法成功地捕获了肝组织内300µm深度的血管，使SBR保持在2.8。在肝脏血管成像方面，该系统所达到的深度可以与多光子荧光成像系统相媲美。

本工作的新颖之处在于利用带宽窄、芯径小的光纤WDM来取代传统共焦系统中常见的二向色镜和针孔。这使得共焦系统中的光源、扫描显微镜和探测器可以通过光纤轻松连接，从而使整体系统结构更简单，调整更容易。基于WDM的简化共焦系统表现出改进的长期稳定性和再现性。

然而，窄带宽和小芯直径虽然有利于系统简化，但也对荧光探针的选择施加了一定的限制。由于商用光纤WDM的波长选择性和带宽有限，目前需要使用具有宽激发光谱和高亮度的量子点作为荧光探针。

为了克服这一局限性，未来的工作可能涉及设计适合特定荧光探针或成像场景的片上WDM器件。一方面，有机荧光探针具有更高的生物相容性，但它们通常具有较小的斯托克斯位移。因此，片上WDM器件可以设计为与材料的吸收和发射特性相匹配。通过设计具有更大荧光透射带宽的设备，可以更有效地利用荧光。另一方面，可以探索光学显微成像的极限。较长波长的激发光在组织中的散射系数较低，能够有效地聚焦于更大的深度，并为深层组织成像提供优势。此外，在NIR IIx（1400-1500 nm）和NIR-III（2080-2340 nm）波段适当增加吸水率可以有效地耗尽散射的荧光光子，从而增强图像SBR。量子点具有宽激发光谱和可调荧光发射波长，特别适合探索共聚焦显微镜中的各种NIR成像窗口。未来，通过设计合适的片上WDM器件，简化的近红外共聚焦显微系统可以适应更广泛的荧光探针和应用场景。

本文成功设计了一个NIR-IIb荧光共聚焦显微系统，该系统结合了光纤WDM设备。该系统具有一系列优点，包括设计简单、易于调整和出色的成像深度。它因其对生物组织结构进行高度特异、清晰和细致成像的能力而脱颖而出。预计这项技术将在未来的生物医学研究领域得到广泛应用。

参考文献

Mou X, Wu T, Zhao Y, et al. From Optical Fiber Communications to Bioimaging: Wavelength Division Multiplexing Technology for Simplified in vivo Large‐depth NIR‐IIb Fluorescence Confocal Microscopy[J]. Small Methods, 2024: 2401426.

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