本文要点：本文中，设计了可改变大小的 NIR-II纳米治疗剂(BBT-HASS@FPMPL NPs)，以同时增强在深部肿瘤组织中的穿透和滞留，从而实现精确成像和有效的PTT 治疗。BBT-HASS@FPMPL NPs表现出 pH 触发的电荷逆转行为，肿瘤微环境介导的大小转换，以及随后的游离BBTN+释放的过程通过胞质转运进入深部肿瘤组织。结合 BBT-HASS @ FPMPL NPs 的 NIR-II 荧光和光热特性可实现NIR-II 荧光图像引导光热治疗，有效抑制皮下肿瘤。由于良好的细胞摄取、在肿瘤组织中的深度渗透和 NIR-II 荧光图像的高分辨率，仅注射一剂即可持续 6 天。作者期望将 NIR-II 荧光的高分辨率与深度肿瘤穿透和长的肿瘤内滞留相结合的这种纳米治疗平台可用于实时监测肿瘤过程、精确诊断和增强的光疗。

图1. BBT-HASS@FPMPL纳米粒子的合成与表征

使用FTIR光谱分析 FPMPL 的结构，1705cm^-1处的峰归因于 DMMA 的 C–C(图1a)，表明成功将DMMA绑定到EPL，在 1115cm^-1和 2886cm^-1 处的 C–O 和 C–H 拉伸振动峰值表明成功引入了 FA-PEG。为了实现电荷反转特性和尺寸减小，BBT-HA NPs被PEG-FA修饰的聚赖氨酸（FPMPL）外壳进一步封装，以产生BBT-HASS @ FPMPL NPs。图1c表明，酸性条件可以导致BBT-HASS @ FPMPL NPs的电荷反转。图1e显示，在pH 6.5下用GSH和透明质酸酶（Hyal）同时处理后，BBTN+能够从BBT-HASS @ FPMPL NPs释放。这揭示了在 pH 6.5 时，通过Hyal和 GSH 共同作用，有利于BBTN+在肿瘤深部组织的有效渗透和滞留。

图2. BBT-HASS@FPMPL NPs的光物理性质和光热性能

如图2a所示，BBT-HASS@FPMPL NPs显示出从 600 -1000 nm的强而宽的吸收带，这可以归因于BBTN+片段；并且在约 1101 nm 处也显示出强烈的 NIR-II 发射带，这表明是一种潜在的 NIR-II 成像剂。BBT-HASS@FPMPL 的升温与浓度和激光功率密度呈正相关，进一步计算出BBT-HASS @ FPMPL NPs的光热转换效率为 20.4 %(图2e)。经过 5 次激光辐照加热/冷却循环后，最高温度仍可达到与原始纳米粒子相同的水平(图2f)，显示出BBT-HASS@FPMPL的良好的光热稳定性和在光热治疗上的巨大潜力。

图3. 通过三维4T1 细胞球体模型对BBT-HASS@FPMPL NPs进行体外渗透评估

图4. BBT-HASS @ FPMPL NPs在 4T1 肿瘤细胞中的特异性滞留增强

图3 表明BBT-HASS @ FPMPL NPs能有效进入4T1细胞，并且加入胞吞抑制剂NaN₃ 后，荧光强度显著降低，而胞吐抑制剂vacuolin-1 处理的细胞荧光更强(图3a，b)。图3c-e表明在 pH 6.5 时发生完全电荷反转并且FPMPL外壳的pH依赖性阳离子化和脱离可以促进肿瘤穿透。这一发现揭示了BBT-HASS@FPMPL NPs在酸性条件下的渗透能力可能是由跨细胞转运引起的。

图4 表示BBT-HASS@ FPMPL NPs的 HA/FA 双靶向能力有利于细胞摄取。并且经过引入 HA 和二硫键后，游离BBTN+可从BBT-HASS@FPMPL NPs释放并与肿瘤微环境中硫醇和 Hyal反应，以延长滞留时间。BBTN+信号随着孵育时间的推移而逐渐增加，与初始强度相比，第2天BBTN+的平均荧光强度增加了10.3倍。综上所述，这些现象表明BBT- HASS@FPMPL NPs可能是一种用于肿瘤长期成像的特异性 NIR-II 探针。

图5. BBT-HASS@FPMPL NPs的体外细胞毒性分析

通过 MTT 法评估BBT-HASS @ FPMPL NPs的增强光热治疗效果，并用中性共轭BBT NPs与BBT-HASS @ FPMPL NPs进行比较。如图5、b所示，4T1 细胞在激光照射下用BBT-HASS @ FPMPL NPs处理时，细胞存活率随着浓度的增加而逐渐降低。图5c通过 Calcein-AM/PI 染色进一步验证了BBT-HASS @ FPmpl NPs增强的 PTT 疗效。图5d使用膜联蛋白V-FITC/PI 凋亡试剂盒，通过流式细胞仪分析评价细胞凋亡情况。本发现揭示了BBT- HASS@FPMPL NPs能够显著提高 PTT 疗效。

图6. 在荷瘤小鼠中通过BBT-HASS@FPMPL NPs进行体内 NIR-II 荧光成像和实时肿瘤监测

考虑到BBT-HASS @ FPMPL NPs具有良好的NIR-II 荧光发射，于是在4T1肿瘤小鼠中检测了它们的 NIR-II 成像性能。图6a-d表明，由于BBT-HASS@FPMPL NPs具有良好的NIR-II光学空间分辨率和对比度，可改善体内图像。如图6e所示，BBT- HASS@FPMPL NPs可主动靶向肿瘤组织，注射BBT-HASS@FPMPL NPs仅 2 h，在肿瘤部位即可检测到明显的NIR-II 荧光信号。BBT-HASS @ FPMPL NPs在肿瘤区域的荧光强度在 24 h内逐渐增强(图6f)，12 h 时信噪比达到最大值 7(图6g)。结果证明BBT-HASS@FPMPL NPs可作为高效的 NIR-II 探针，用于实时可视化肿瘤过程，并可精确测量肿瘤的真实大小。

图7. 体内 PTT 疗效及组织学分析

在 4T1 荷瘤裸鼠中研究了BBT-HASS @ FPMPL NPs的体内光热效应和抗肿瘤效应。随着激光照射时间的延长，PBS 组的肿瘤温度几乎保持相同，而激光照射下BBT-HASS@FPMPL NPs组肿瘤温度迅速升高至 53.2 ℃。且激光照射下接受BBT-HASS @ FPMPL NPs治疗的小鼠，其瘤体生长明显受到抑制，说明BBT-HASS @ FPMPL NPs具有良好的光热特性和抗癌功效。图7g显示小鼠体重在实验过程中没有明显波动，表明BBT-HASS @ FPMPL NPs没有明显的系统毒性。H&E、TUNEL、Ki67染色均证实了BBT-HASS @ FPMPL NPs的良好 PTT 疗效。通过血液学和血液生化分析，BBT-HASS@FPMPL NPs组的血液学指标与 PBS 组和对照组相比几乎没有差异，表明无肝和肾毒性。

参考文献

Su, P.; Sun, W.; Wang, G.; Xu, H.; Bao, B.; Wang, L., Size transformable organic nanotheranostic agents for NIR-II imaging-guided oncotherapy. Journal of Colloid and Interface Science 2024, 654, 740-752.