本文要点：多重荧光成像主要应用于细胞成像，NIR区域的多色荧光成像能够可视化体内的各种生物过程，适用于机制研究、疾病诊断和成像引导手术，可提供体外成像无法获得的信息。传统上，多重荧光成像可以通过使用共同激发波长、不同检测通道，然后进行光谱分解来完成。然而，由于NIR区域的分辨率和对比度各异，每个检测通道的分辨率将有显著差异。可以通过多路复用激发和单通道检测以避免该问题，使所有窗口具有一致的分辨率和对比度。为了实现多路复用成像，非常需要具有良好间隔的吸收和发射光谱的NIR-II荧光探针相互匹配，可以用单独的激发波长激发并在相同的NIR-II发射波长中检测。

目前，大多数近红外荧光探针具有较小的斯托克斯位移、突出的自猝灭特性，并且倾向于流出细胞，不利于体内高对比度的细胞跟踪。因此，迫切需要开发具有长发射波长、大斯托克斯位移、优异的抗猝灭能力且在细胞中停留时间长的近红外荧光团。

鉴于此，本研究开发了两种菁染料：FNIR-1090和IR-765，其中FNIR用于标记癌症细胞，在近红外II区（NIR-II）进行多路激发和单通道检测，用于体内双色成像（方案1）。

方案1. 双色体内荧光成像和使用FNIR-1090标记癌症细胞

FNIR-1090是在Pr-1099衍生物上通过SRN1置换反应与1-乙基哌嗪连接而构建的，在连续808nm激光照射下显示出优异的量子产率（0.074%）和令人满意的光稳定性。IR-765是通过Vilsmeier-Haack试剂与2-（3,5,5-三甲基环己-2-亚苯基）丙二腈（TEMO）的一步反应合成的，在连续660nm激光照射下具有高效的光稳定性、良好的生物相容性、高量子产率（6.7%）和优异的抗光漂白性能。尽管IR-765发射最大值不在NIR-II区域，但极好的荧光亮度使其荧光发射尾部在NIR-II成像系统中很容易被检测到。

图1. FNIR-1090（a）和IR-765（b）的吸收与发射光谱

使用NIR-II成像系统研究两种探针在不同介质（DMSO，4%吐温-20/PBS，1×PBS缓冲液和4T1细胞悬浮液）中的串扰。发现FNIR-1090和IR-765在不同介质中都保持了明显的荧光信号，不会相互干扰。

图2. FNIR-1090和IR-765在不同介质中的串扰

在含10% FBS的PBS溶液中，IR-765和FNIR-1090分别在660nm和808nm激光连续照射1小时后，相对荧光强度没有明显变化，表现出优异的光稳定性。在37℃孵育下，FNIR-1090的相对荧光强度相当稳定。而IR-765的荧光信号在3小时后达到最大值，然后保持相对恒定，可能是由于IR-765和FBS蛋白内部疏水结构域结合，导致荧光强度增高。

图3. FNIR-1090和IR-765的光稳定性和化学稳定性

将IR-765腹腔注射到小鼠体内，然后将FNIR-1090标记的4T1细胞静脉注射到小鼠体内，用于体内双色成像。如图4，探针分布清晰可见，IR-765和FNIR-1090的信噪比分别约为3.5和2.6，光学串扰可以忽略不计。IR-765和FNIR-1090显示出优异的体内双色NIR-II成像能力，高对比度双通道成像可以对不同的组织进行清晰的区分，促进对深层组织进一步的探索，以获得多路信息。

图4. 小鼠体内多重荧光成像

总之，本研究设计并合成了两种新型菁基荧光探针（FNIR-1090、IR-765），用于体内实时双色近红外成像。两种探针吸收光谱几乎完全分离，荧光串扰可忽略不计，且表现出优异的光稳定性、化学稳定性、大斯托克斯位移，以及良好的组织穿透能力和高分辨率，是可用于生物医学开发的优质NIR-II区荧光染料。

参考文献

Huixian Jia, Yujie Liu, Wei Tang, Chenghui Liu, Xinrui Duan, Near-infrared fluorescent probes for non-invasive, real-time, and dual-color in vivo NIR-II imaging, Sensors and Actuators B: Chemical. 396 (2023) 134595.

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