本研究通过增强给电子能力、减少供体-受体（D-A）距离合成了一种NIR-II荧光小分子，具有聚集诱导发射特性和高亮度，且最大发射超过1200nm，是一种稀缺的明亮长波长发射有机染料。所设计的纳米荧光团具有延伸至1900nm的明亮荧光信号，与背景抑制成像窗口相匹配，使组织图像的信噪比达到100以上，组织穿透厚度约为4-6 mm。此外，几乎可以在零背景下识别出强烈负染的管腔内病变。该方法可以为未来长波长NIR-II分子设计和深度、高散射组织的生物医学成像提供新的途径。

图1. 具有明亮和波长扩展发射的NIR-II荧光团的分子工程。a通过供体工程和光学响应设计的分子。b 2FT-oCB在单体、三聚体和分子堆积模式下的单晶结构。c 溶解在THF中的四个分子的归一化吸收和d 归一化PL光谱。e分子的PL峰值强度与ƒ_w的关系图。I和I₀表示具有特定ƒ_w的混合物和纯THF（ƒ_w＝0）中的峰值强度。插图显示了ƒ_w从50%到90%的放大曲线。

为了进一步研究染料的荧光性质，作者使用生物相容性表面活性剂Pluronic F-127通过纳米沉淀法将染料封装成荧光点（图2a）。除了2MPT-oCBdots外，其他3种染料点相较于溶液状态均显示出最大吸收波长红移（图2b）；这些荧光点分别在NIR-II区域显示荧光，比它们的溶液状态稍微蓝移（图2c）。2MPT-oCB和2FT-oCB点优异的吸收（>840nm）和发射（>1100nm）特性特别有利于高质量的生物成像。使用七种不同的长通（LP）滤光片记录具有相同浓度的4种染料点的荧光图像（图2d）。随着滤光片波长从1100增加到1500nm，在2FT-oCB点中始终观察到强烈的荧光信号，且在1400nm LP滤光片下具有最强的荧光强度。因此，选择2FT-oCB点用作接下来的体内成像。

以1,2-二氯乙烷（0.5%）中的IR-26为参考，超过900nm的2FT-oCB点的QY为~0.95%，超过1400nm的QY为~0.11%（图2e）。F-127涂覆的2FT-oCB测量直径约为50nm（图2f）。在连续激光照射30分钟后，2FT-oCB点几乎没有显示出荧光强度的下降（图2g），证明它具有优异的光稳定性。

为确定NIR-II荧光非峰成像的最佳高通检测区域，考虑到水中2FT-oCB点的发射光谱和水的光吸收特性（图3a），通过蒙特卡罗方法模拟了垂直线样品在作为背景的水平线上1300-1700 nm范围内的成像（图3b）。计算的变异系数（C_v）显示， NIR-IIx+ NIR-IIb（1400-1700 nm）图像的扩散抑制效果最好。接着在静脉注射1×2FT-oCB点的磷酸盐缓冲盐水（PBS）溶液后，对小鼠进行全身血管成像。结果显示，1400LP收集抑制了强背景，使血管网络轮廓清晰（图3c–e），肝脏上方的血管显示出1.27的最佳信噪比（图3f）。在快速傅立叶变换（fast Fourier transform, FFT）的结果中可以看出图像不同区域的空间频率分布（图3g–i）。高空间频率的强度与受约束的光子散射近似正相关，且在光吸收峰值波长附近出现最大值（图3j）。由于水在~1450 nm处的强烈光吸收，由散射成分产生的背景被高度抑制，导致NIR-IIx+ NIR-IIb图像有更高的空间频率，甚至比一直被认为质量最好的NIR-IIb图像更高。

图3. 生物组织中的天然水优化了近红外荧光成像。a 2FT-oCB点的放大发射光谱和水在可见近红外成像窗口中的吸光度。b 通过蒙特卡罗方法对深层组织中的2FT-oCB点（水溶液）进行成像模拟。静脉注射2FT-oCB点后，同一小鼠的c 1300LP、d 1400LP和e 1500LP全身荧光图像。比例尺，10 mm. f（c–e）中沿血管靛蓝线的横截面荧光强度剖面。FFT后的g 1300LP、h 1400LP和i 1500LP图像的空间频率图。空间频率从地图中心向外逐渐增加，颜色条表示强度。j（g–i）的空间频率分布。a和j中的a.u.表示任意单位。

在生物相容性实验中发现，2FT-oCB点没有表现出明显的毒性迹象。通过分析水和重水的典型吸收光谱发现，以水作为溶剂会导致NIR-II区域的荧光损失，而2FT-oCB dots在重水中的分散能够恢复1450nm附近的发射损耗，因此通过超滤后重新洗脱浓缩2FT-oCB dots制得重水分散体。在此基础上，作者进行了体内荧光结肠、膀胱和子宫成像。

结肠灌注重水分散的2FT-oCB dots后，在NIR-II区域的不同成像窗口中进行荧光结肠造影。（图4a，补充图44）。所提出的NIR-IIx+ NIR-IIb检测的非侵入性成像模式，即使在严重组织紊乱的3-6mm深度下，也能提供接近50的SBR（~46.6）（图4b）。为了从成像背景定量划分目标区域，使用三个阈值（TH=0.27、0.32和0.37，表示所选区域中最高亮度的27%、32%和37%被设置为信号/背景确定的阈值），通过二值化处理所选原始结果（图4c）。总体趋势是，计算面积随着成像波长的红移而缩小（图4d）。将计算出的分割结肠的平均强度作为信号，将其余部分的平均强度视为背景来确定面积SBR，可得SBR值在1400LP收集时达到最大值。

膀胱内滴注重水分散的2FT-oCB点后，通过皮肤和肌肉进行NIR-II荧光膀胱造影。将膀胱的非侵入性NIR-II荧光图像设置为绿色通道（图4e）。组织深度为2-3 mm的情况下， NIR-IIx+ NIR-IIb荧光膀胱图像的SBR达到~46.5（图4f）。二进制和分割膀胱图像表明NIR-IIx+ NIR-IIb光谱窗口最小化了散射干扰（图4g）。膀胱信号面积和面积SBR的计算值还证明了1400-1700 nm的成像性能最佳（图4h）。此外，将打开腹部后的膀胱图像设置为红色通道进行比较，然后将绿色和红色图像合并为一个图像，并将一致性高的区域显示为黄色，并通过结构相似性指数测度（structural similarity index measure, SSIM）进行精确量化以帮助图像质量评估（图4i）。1400-1700 nm的合并膀胱图像显示出最佳匹配，并且性能超过NIR-IIb区域。整个SSIM图中的平均SSIM指数如图4j所示。随着成像窗口的延长，SSIM指数逐渐提高，在1400-1700 nm图谱上达到峰值，与NIR-II非侵入性可视化中的NIR-IIx+ NIRIIb检测具有最高的一致性。

子宫灌注重水分散的2FT-oCB dots后，将小鼠下腹暴露于793nm连续波（CW）激光的照射下。NIR-II及NIR-IIx+ NIRIIb荧光子宫图像分别如补充图55a、图5a所示。即使组织厚度为4-6 mm，1400 nm LP图像也能提供最佳成像质量（图5b），且1400-1700 nm窗口提供了最精确的区域分割和最高的面积SBR值（图5c）。在NIR-IIx+ NIR-IIb图像中，右子宫直径计算值的FWHM最小，为1.69mm（图5d）。

之后，作者发现利用2FT-oCB dots可以实现几乎为零背景的精确宫内残留物检测。在吸收峰周围的光谱区域内，水的光吸收将耗尽散射光子，而残留组织往往富含水，这导致光吸收而在明亮信号周围产生强烈的阴性染色，可以为进一步诊断提供鲜明的对比。将超吸收性树脂填充到子宫腔中，充当微小异物（图5e）。在腹部缝合和宫内注射重水分散的2FT-oCB dots后进行体内成像（图5f）。结果如图5g所示，随着子宫蠕动和辅助按压，组织深度以及组织中断减少，宫内异物越来越清晰可见。

为了更好地模拟内源性残留物，使用了一批怀孕小鼠（图5h）。在宫内注射重水分散的2FT-oCB dots后，可以清楚地显示子宫中具有强阴性染色的胎儿（图5i–k）。将1300LP、1400LP和1500LP图像放入三个通道，分别进行红色、绿色和蓝色的伪彩色增强。三个通道的合并图像通常显示由三原色整合的白色（图5l）。然而，离重叠结构的中心越远，合并的颜色从白色逐渐加深到紫色，说明1300LP和1500LP通道中有相对较高的光扩散。如图5m 所示，NIR-IIx+ NIR-IIb检测可以准确勾勒胎盘轮廓。

然后，进一步进行漏流产的检测。在注射脂多糖后第6天，小鼠在宫内灌注重水分散的2FT-oCB dots后成像。从图5n所示的体内NIR-IIx+ NIR-IIb图像中，可以在右侧子宫中观察到胎儿，并且可以在左侧子宫中精确检测到一些残留的妊娠组织。由于残留的妊娠组织含有大量的水，组织背景在NIR-IIx+ NIR-IIb窗口中被有效抑制，导致强烈的阴性染色。根据图5n中的分析， SBR计算值超过100。在轻微的辅助按压和适当的位置调整后，组织阻塞改善，右子宫中的胎儿变得更加清晰（图5o）。比较打开腹部之前（图5n，o）和之后（图5p）的图像，可知皮肤和脂肪组织的阻碍不会干扰NIR-IIx+ NIR-IIb检测的精确诊断。最后，进一步切开子宫进行切片和H&E染色（见图5q）。右侧子宫的切片图像显示了小鼠胎儿的完整结构（图5r），而左侧则包含一团残留的妊娠组织（图5s），与体内NIR-IIx+ NIRIIb观察结果一致。这表明明亮的NIR-IIx+ NIR-IIb发射和周围强阴性染色的荧光团的有效标记光吸收峰组成双可视化，为准确诊断宫内残留提供了强有力的工具。

图5. 宫内异物在体内的精确检测。a 典型的NIR IIx+ NIR IIb荧光滞后成像图像。比例尺，5 mm. b线沿（a）和补充图55a中的白线的SBR结果。c二值化后的信号面积和子宫图像在不同光谱区域中的面积SBR。d沿（a）和补充图55a中蓝线的不同收集光谱区域中的FWHM。e宫内异物检测操作示意图。f手术后小鼠腹部缝合的照片。g具有蠕动和手动按压的NIR IIx+ NIR IIb荧光图像以及具有代表异物的黑点的二值图像。白色箭头和绿色箭头指出异物。比例尺，10mm。h怀孕的插图。用i 1300 nm、j 1400 nm和k 1500 nm LP检测孕鼠子宫的荧光图像。l红色（1300LP）、绿色（1400LP）和蓝色（1500LP）通道的合并图像。m胎儿用白色箭头标记的1400LP图像。比例尺，10 mm。n打开腹部前流产模型的荧光图像和残留妊娠组织沿黄线的横截面荧光强度分布。a.u.在这里表示任意单位。o荧光图像和沿胎儿黄线的横截面荧光强度分布。比例尺，10mm。轮廓的高斯拟合由（n）和（o）中的棕色线表示。a.u.在这里表示任意单位。p流产模型在打开腹部后的荧光图像。q孤立子宫的照片。三个独立实验中r右子宫（含胎儿）和s左子宫（含残留妊娠组织）的代表性组织学图像。比例尺（r），1 mm；比例尺（s），单位：500μm。

总之，所合成的2FT-oCB dots可以被列为少数同时实现长波长光学响应、强光吸收和超过1400/1500nm的高QY的荧光团之一，可作为长波长生物医学荧光成像的潜在候选者，本研究的发现将为进一步的荧光团制备和生物医学研究带来变革。

参考文献

Feng, Z.; Li, Y.; Chen, S.; Li, J.; Wu, T.; Ying, Y.; Zheng, J.; Zhang, Y.; Zhang, J.; Fan, X.; Yu, X.; Zhang, D.; Tang, B. Z.; Qian, J., Engineered NIR-II fluorophores with ultralong-distance molecular packing for high-contrast deep lesion identification. Nature Communications 2023, 14 (1).

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