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染料探针 | 利用对称破坏电荷转移机制在短波红外光谱区域开启对体内血管系统氧化还原稳态的荧光传感

发布时间：2023-08-30 14:19

本文要点：几十年来，过量服用对乙酰氨基酚（APAP）一直是急性肝功能衰竭（acute liver failure, ALF）的主要原因。目前，APAP诱导的肝毒性的发病机制仍有待完全阐明。短波红外光谱区（shortwave infrared spectral region, SWIR）功能性体内成像在疾病诊断、荧光引导手术和体内药理学方面具有广泛的潜力。因此，用于体内血管系统氧化应激的SWIR荧光探针可以为APAP毒性的发病机制提供一个独特的视角。


近年来，已经有一些关于具有SWIR区域吸收的染料的报道。然而，由于缺乏有效的荧光猝灭机制，基于这些SWIR染料的探针设计仍然很困难。本研究发现，利用对称性破缺电荷转移是一种开发具有SWIR荧光团的探针的可行方法。同源荧光共振能量转移（homo fluorescence resonance energy transfer, homo-FRET）是一种两个具有吸收/发射光谱串扰的相同荧光团分子间的长距离偶极-偶极荧光猝灭机制。由于缺乏热力学驱动力，且对两个荧光团之间的距离和取向要求严格，它并不是一种特别强的猝灭机制。当两个分子接近形成刚性二聚体时，一种称为对称性破缺电荷转移（symmetry-breaking charge-transfer, SBCT）的短距离超快分子内电子耦合便可起作用，将发射振动弛豫激发态转移到一种新的、能量较低的电荷转移态（通常是暗态）。



七甲基菁（Cy7）是一种经典的长波长荧光染料，它的最大吸收波长可以用不同的头部集团来调节，例如具有苯并吲哚头基团的IR1080，最大吸收波长约为1000nm。本研究基于IR1080合成了第一个V型不对称菁二聚体（VAD1080）（图1），它的两个菁单体被锁定在非常接近的位置，实现轨道重叠，从而有效地荧光猝灭。


图1. VAD1080和IR1080的合成


作者首先研究了所合成的IR1080与VAD1080在CH2Cl2中的光谱特征。IR1080的吸收和发射波段具有良好的镜像关系（图2A-B），荧光量子产率为1.2%（以IR1061作为参考）。如图2E-H, VAD1080的吸收光谱明显偏离IR1080的吸收光谱，其三峰光谱特征与VAD1080的独特倾斜结构特征一致。VAD1080仍然可发射荧光，尽管其荧光量子产率（Φ=0.08%）与IR1080相比大大降低。


进一步用CH2Cl2中的瞬态吸收光谱研究了VAD1080的激发态动力学，并与IR1080的激发态进行了比较，以阐明荧光猝灭的光物理起源。在激发时，观察到IR1080的基态漂白（ground state bleaching , GSB）和受激发射（stimulated emission, SE）。在接下来的100ps左右，GSB信号以自发发射的方式恢复。根据GSB和SE的信号通过非线性拟合计算出两个寿命，即溶剂化/振动弛豫可能为1.4ps，荧光为33ps；而对于VAD1080，其GSB信号经历了从1047nm到1000nm的光谱偏移，表现出存在寿命为0.6ps的快速激发态路径，可能进入寿命为6.5ps的暗对称性破缺电荷转移态。由此验证了SCBT是SWIR菁染料可行的荧光猝灭机制。


图2. IR1080和VAD1080在CH2Cl2中的光谱特征。（A–D）IR1080的UV-Vis吸收、荧光发射光谱以及去卷积吸收和发射光谱。（E–H）VAD1080的UV-Vis吸收、荧光发射光谱以及去卷积吸收和发射光谱。（I）IR1080的两个不同波长的瞬态吸收光谱和（J）激发态动力学。（K）VAD1080的两个不同波长的瞬态吸收光谱和（L）激发态动力学。


已知IR1080的多甲基甲酰胺易于被亲核活性氧物种破坏，例如与病理性氧化应激有关的ONOO-、ClO-和H2O2。作者设想，VAD1080菁支架的破坏将去除SCBT途径，从而恢复剩余菁骨架的SWIR发射（图3A）。因此，VAD1080可能是一种可用于氧化应激的开启荧光探针。

为了评估策略的可行性，作者首先研究了VAD1080在DMF水溶液（v/v=1:1）中对ONOO-的反应性。探针溶液的吸光度为0.6，随着ONOO-当量的增加而连续下降。这与所提出的ONOO-氧化裂解VAD1080结合主链的机制不一致（图3B）。基于荧光的滴定的趋势则有所不同。当ONOO-的浓度从0μM逐渐增加到11μM时，溶液在1004nm处的荧光强度达到峰值，增强了61倍。据推测，这是由于VAD1080的两个菁主链中的一个被切割，消除了通过SCBT的荧光猝灭，导致荧光显著增加；而进一步添加ONOO-（11–21μM）则导致荧光强度逐渐降低，这可能是由于剩余的菁染料被过量的氧化物种破坏，荧光随之消失（图3C）。这显然不符合预期，但如此高浓度的氧化物种从生物学角度来看是无需考虑的。

接着还研究了VAD1080和ONOO-之间的反应动力学，反应在约100s内完成（图3D）。进一步测试发现VAD1080也对其他高氧化物种（如ClO-和·OH）表现出高荧光开启反应，而生理水平的生物硫醇与温和的反应性物质（如H2O2）不会导致荧光开启（图3E）。这些结果证实VAD1080可用于高氧化性物种的生物传感。


图3.（A）VAD1080对氧化物种的检测机制。（B）在H2O:DMF（v/v =1:1，含1%TFA）的混合物中，VAD1080（20μM）对ONOO-的吸收滴定和（C）荧光滴定。λex=940 nm。（D）VAD1080（20μM）与ONOO-的反应动力学。（E） VAD1080（20μM）对各种生物硫化物（每个物种5当量）和不同氧化物种的荧光响应。（H2O2：5当量；·OH：1当量；ClO-：0.5当量；ONOO-：0.5当量。）


最后，作者在小鼠模型中展示了对APAP诱导的氧爆作用的实时体内荧光成像的概念验证应用。用DSPE-PEG2000磷脂胶束包封VAD1080，以提高其在PBS中的溶解度。对照组小鼠静脉注射PBS和VAD1080胶束；接下来的三组依次注射不同剂量的APAP以及VAD1080；最后一组小鼠注射APAP（300 mg/kg）、N-乙酰半胱氨酸（NAC，300 mg/kg）和VAD1080。在第一个60分钟内，在对照组的脉管系统中观察到微弱信号（图4a，第1行）。肝脏中的信号在60分钟内变得明显，并在随后的几个小时内逐渐增强。注射150 mg/kg低剂量APAP的小鼠具有良好的耐受性，血管系统或肝脏中没有荧光发射的明显增强（图4a，第2行）。用高剂量APAP处理的小鼠的荧光强度产生了明显更强的剂量依赖性荧光信号，表明发生了氧化应激（图4a，第3/4行）。这种氧化应激可以通过注射N-乙酰半胱氨酸（NAC）来抑制（图4a，第5行）。肝脏荧光开启的动力学与APAP诱导肝损伤的相关文献中所报道的一致。因此，本研究中肝脏荧光强度是肝脏氧化损伤的良好指标。

作者分析，肝脏中的荧光开启可能是肝脏中探针直接氧化和肝脏中远端生成的氧化产物积累的综合结果，而两者都与血管系统的氧化应激有关。有趣的是，在第一个小时内荧光开启主要在脉管系统中发现，而肝脏中的信号直到60分钟后才开始积累（图4A, C）。这似乎表明APAP首先诱导了血管系统中的氧化。根据先前的文献，在APAP给药的早期阶段（约1小时），ONOO-确实会在正弦内皮细胞中产生，导致酪氨酸的硝化，从而对血管造成损伤。免疫组织化学实验结果也证明了这一观点（图4B）。血管系统的持续氧化应激最终导致肝脏中的氧化应激和组织损伤，正如肝脏中硝基酪氨酸（NT）蛋白加合物的免疫组织化学染色所反映的（图4D），而NAC可以抑制NT蛋白加合物的存在。


图4. （a）BALB/c小鼠腹膜内接受PBS（对照组）、APAP（300 mg/kg）和NAC（300 mg/kg）、以及接受APAP（150 mg/kg、300 mg/kg，500 mg/kg），随后静脉注射VAD1080磷脂胶束（1 mg/mL，100μL）的代表性图像。在注射VAD1080后2、30、60、90、120、180、240和300分钟采集图像。（b）用不同物质处理的小鼠肝脏的代表性H&E组织学。（c）注射VAD1080后的各种物质处理的小鼠肝脏随时间的相对荧光强度。（d）APAP注射（300mg/kg）后0.5、1、3小时肝切片的硝基酪氨酸（NT）蛋白加合物的免疫组织化学染色。采用InGaAs CCD记录图像。激发光为808nm，180mW/cm2；1200nm LP滤光；曝光时间1000ms。****代表P＜0.0001。


总之，本研究开发了一种用于SWIR区域吸收的菁染料“off-on”型荧光探针的设计原理，设计了一种独特的V形不对称菁二聚体。由于其苯并吲哚头基的平坦性质，两个菁单体的近端堆叠在一起，以促进SBCT。这种SBCT是一个ps级的快速过程，可以有效地与辐射衰变竞争，并有效地猝灭SWIR染料的荧光。在与ONOO-反应时，VAD1080两种构成菁染料的头基可以被裂解，以抑制SBCT过程并恢复剩余菁荧光团的SWIR荧光。用APAP处理的小鼠展示了VAD1080在体内传感氧化应激的可行性。并且发现血管系统中的氧化爆发先于肝脏中的氧化爆发。本研究为APAP的毒理学提供了新的见解，为APAP过量的干预提供了措施。


参考文献

Wang, M.; Wang, X.; Wei, R.; Zhang, Y.; Chen, J.; Luo, X.; Qian, X.; Yang, Y., Symmetry-breaking charge-transfer enables turn-on fluorescence sensing in the shortwave infrared spectral region for in vivo vasculature redox homeostasis. Sensors and Actuators B: Chemical 2023, 394.


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