本文要点：活体动物的生理学研究常常具有侵入性，受到身体约束、麻醉甚至安乐死的限制。使用不受物理和化学约束的非侵入性方法在临床前研究被广泛应用。如计算机断层扫描(CT)和磁共振成像(MRI)，但由于时间分辨率低、视野要求低以及对造影剂的灵敏度有限，其在自由移动的小鼠中的应用有限。光学技术与荧光剂偶联能够提供行动自由老鼠的结构、功能、遗传或代谢对比，已经作为替代方案出现。短波红外(SWIR, 1,000-1,700 nm)荧光成像在可视化小鼠生物结构方面表现出色。
SWIR区域的光物理特性使其成为了光学体内成像的最佳方案，许多SWIR发射探针被开发应用于生物医学领域，包括临床批准的吲哚菁绿(ICG)和相关的有机染料，以及量子点、碳纳米管和稀土掺杂纳米颗粒等用于实现SWIR成像。此外，SWIR敏感相机技术的进步提高了成像的分辨率、灵敏度和效率，如基于InGaAs的探测器。
SWIR成像已被广泛用于小鼠血管检测、代谢活动评估、可视化淋巴血管和生命体征监测等，但大多数应用于麻醉动物。相关研究表明SWIR成像能够应用于自由活动的小鼠。本篇文章结合高对比度SWIR发射荧光团和SWIR检测技术，实现了多达4个不同通道的实时多通道成像记录，在自由活动的小鼠中实现了非侵入性脑活动和脑外周器官串扰成像，具有巨大潜力。
1. 自由行为小鼠光学成像的实验策略
本篇文章中作者使用了ICG, JuloChrom5, Chrom7和JuloFlav7，可以在1-10 ms的曝光时间范围内进行非侵入性的清醒小鼠成像。同时，为了获得最佳的染料激发，荧光团吸收光谱与多色实验中使用的激光线相结合（图1）。
图1
除水溶性的ICG外，其它染料都被包裹在脂质胶束中用于体内注射。为了检测清醒小鼠器官的SWIR荧光发射，作者使用了一个提供小鼠全身视野的35 mm F/1.4镜头和一个最大帧率为300帧每秒(fps)、分辨率为640 × 512像素的单色InGaAs探测器。检测窗口可以选择1000或1150纳米的长通滤光片，这取决于每个实验中使用的荧光团和激光线。
2. 行为自由的小鼠成像的快速采集
对清醒和自由移动的小鼠进行成像需要高时间和空间分辨率以及有利的对比度来解析生物参数，同时考虑动物运动。例如，在自然运动中的老鼠摇晃和搔头，作者发现10毫秒(相当于100 fps)的暴露时间对分辨主要的荧光标记血管是必要的。然而，一些较小的血管只能在3ms时观察到（相当于300 fps）（图2）。
图2. 3ms时获取的单帧图像，以及该帧图像与相邻帧图像的比较
3. 在自由行为小鼠中标记和可视化主要血管
为了使血管标记，长循环胶束配方的Chrom7被静脉注射，注射后45分钟成像。作者观察到信号集中在眼眶周围的主要血管、颅底和后肢(背侧视图;图3)。图像使用968 nm光源和1000 nm长通滤波，以300 fps的速度获得。同时将视频显示速度从300帧/秒降至30帧/秒;然后用慢动作显示鼠标的快速运动，大多数血管仍然可以分辨出来。这说明SWIR成像不仅可以保持全小鼠视野，还能分辨小鼠的精细结构。
图3. SWIR荧光血管成像小鼠在成像室中自由运动
4. 荧光团多路复用在多通道对社会互动小鼠进行正交成像
多路复用成像是临床前成像研究的关键特征。作者利用了激发-多路复用概念:荧光团激发匹配的激光波长以交替顺序打开，同时使用一组长通滤波器在单个检测窗口中收集荧光发射。这种多路复用策略不仅有利于速度，而且保持了一致的分辨率和对比度（图4）。
图4. 多荧光团成像策略示意图: 四种不同的激光匹配四个选定的荧光团的激发光谱与InGaAs探测器同步
为了标记不同的生物结构，作者采用了不同的注射策略，并利用了荧光团的不同生物分布的性质。循环中的ICG分子被肝脏中的肝细胞迅速吸收，并通过胆道排泄到肠道。根据注射后的时间，肝脏和肠道可以以高的信背比（signal-to-background ratio）可视化。为了使肠道可视化，小鼠在ICG静脉注射后5-6小时成像。巨噬细胞丰富的器官，如肝脏、淋巴结和骨骼，在JuloChrom5胶束静脉注射24小时后信号丰富；使用这种策略来提供骨/解剖对比。成像前30-90分钟腹腔注射JuloFlav7胶束，与ICG标记的肠道一起提供腹腔内的补充信息。最后，为了标记血管系统，成像前15-30分钟静脉注射长循环Chrom7胶束。使用相同的实验方法，作者对两个笼内社会互动的小鼠进行了成像(图5)。在本次实验中，作者选择1150 nm的长通滤光片，减少了总收集光，因此将曝光时间增加到7.8 ms。最终4通道视频的有效帧率是30fps保证速度，但当鼠标表现出特别快速的运动时，对较小结构的解析能力有所降低。最后，为了最小化荧光团串扰并避免需要后处理工具来区分不同通道，作者通过降低造影剂浓度，同时以波长相关的方式增加入射激光功率密度。从而获得了可区分的成像通道，尽管在单个通道中存在一些荧光团串扰。
图5. 成像室内小鼠进行社交互动时的腹侧成像
5. 从行为自由的老鼠身上追踪器官
为了确定每个器官的位置，从带有标记器官的视频中提取生理相关数据。作者选择使用用于姿态估计的鼠标跟踪算法来跟踪小鼠器官，利用深度学习方法DeepLabCut用于预测自由移动的老鼠体内器官的位置。首先在数据集的小部分(通常是每次实验帧的10%)上定义感兴趣器官周围的手动ROI选择(标记)。这些标记不仅放置在目标结构上，还放置在外周结构上，以使整个小鼠(背侧或腹侧)能够对齐。然后DeepLabCut使用这个初始选择来训练自己的卷积神经网络，最后使用训练好的模型来预测剩余帧上每个区域的位置，同时作者为了将来的数据提取，在处理管道中将目标结构的每个标记都被转换到视场的中心，外围标记围绕中心标记旋转，以便鼠标的姿态在不同的帧中对齐。最后，可以在结果对齐图像堆栈的目标结构上绘制ROIs，最终用于从跟踪器官中提取定量信息。
6. SWIR荧光成像在神经科学研究中的应用面临的挑战和前景
尽管本篇文章提出的宏观SWIR荧光成像管道与神经科学应用似乎相去甚远，但值得注意的是，SWIR成像已被用于透过皮肤和颅骨的可视化麻醉小鼠的小脑血管或血脑屏障渗漏研究，无创宏观SWIR成像显示其他器官(如肠道和肝脏)的能力也表明，非侵入性脑动力学成像在自由行为小鼠的直接或间接脑成像中有着合理前景，有诸多潜在应用。
参考文献
Arús, B. A.; Cosco, E. D.; Yiu, J.; Balba, I.; Bischof, T. S.; Sletten, E. M.; Bruns, O. T., Shortwave infrared fluorescence imaging of peripheral organs in awake and freely moving mice. Frontiers in Neuroscience 2023, 17.
⭐️ ⭐️ ⭐️
NIR-II in vivo imaging system
高灵敏度 - 采用Princeton Instruments深制冷相机，活体穿透深度高于15mm
高分辨率 - 定制高分辨大光圈红外镜头，空间分辨率优于3um
荧光寿命 - 分辨率优于 5us
高速采集 - 速度优于1000fps （帧每秒）
多模态系统 - 可扩展X射线辐照、荧光寿命、一区荧光成像、原位成像光谱，CT等
显微镜 - 近红外二区高分辨显微系统，兼容成像型光谱仪
有不同型号的样机可以测试，请联系：
艾中凯(博士)
132 6299 1861
⭐️ ⭐️ ⭐️
恒光智影
上海恒光智影医疗科技有限公司，被评为“国家高新技术企业”，上海市“科技创新行动计划”科学仪器领域立项单位。
恒光智影，致力于为生物医学、临床前和临床应用等相关领域的研究提供先进的、一体化的成像解决方案。
与基于可见光/近红外一区的传统荧光成像技术相比，我们的技术侧重于近红外二区范围并整合CT, X-ray，超声，光声成像技术。
可为肿瘤药理、神经药理、心血管药理、大分子药代动力学等一系列学科的科研人员提供清晰的成像效果，为用户提供前沿的生物医药与科学仪器服务。
⭐️ ⭐️ ⭐️
上海恒光智影医疗科技有限公司
地址：上海市浦东新区张江高科碧波路456号 B403-3室
网址：www.atmsii.com
邮箱：ai@atmsii.com
电话：132 6299 1861 （同微信）
扫一扫在手机上阅读本文章
上海恒光智影医疗科技有限公司
专注近红外二区成像技术
关注“恒光智影”公众号
