本文要点：具有NIR-II窗口荧光发射的荧光探针由于其成像深度的增加而得到了广泛的研究。然而，目前报道的NIR-II荧光探针存在合成路线复杂、荧光量子产率(QYs)低等缺点。在NIR-II探针的研制中可采用屏蔽策略来提高其量子产率，但目前这种策略仅用于对称的NIR-II探针的设计，特别是那些基于苯并[1,2-c:4,5-c ']双([1,2,5]噻二唑)(BBTD)骨架的探针。本文报道了一系列基于屏蔽策略的不对称NIR-II探针，这些探针具有合成路线简单、高合成率(90%以上)、高QYs和大斯托克位移等优势。进一步使用D-α-生育酚基聚乙二醇琥珀酸酯(TPGS)作为NIR-II荧光探针(NT-4)的表面活性剂，以提高探针的水溶性，得到TPGS-NT-4 NPs。体内研究表明，具有高QY(3.46%)的TPGS-NT-4 NPs可实现高分辨率的血管造影和有效的局部光热治疗，同时具有良好的生物相容性。本文通过结合血管造影和局部光热治疗来提高肿瘤对纳米光热剂的吸收，同时减少其对正常组织的损伤。
背景：近红外窗口（NIR；700-1700 nm）的荧光团在脑血流和肿瘤微环境的探测中可以提供高对比度的图像。但NIR-I荧光团（NIR-I，700-900 nm）临床应用受到其穿透深度不足（约0.22 mm）的阻碍，NIR-II荧光团（NIR-II，1000-1700 nm）具有更深的穿透深度（约3 cm）、更大的空间分辨率（约100 nm）和良好的信噪比（SBR）等特性，因此，探针的激发波长从NIR-I到NIR-II的深色位移将提高探针的组织穿透深度。
迄今，已报道的有机NIR-II探针根据其化学工程策略可分为两大类：1）结构与花青染料相似的NIR-II探针；2）基于BBTD的供体-受体-供体（D-A-D）荧光团。有机NIR-II荧光团往往由于其分子内和分子间相互作用的堆积而导致荧光淬灭，量子产率低。可以通过提高空间位阻来防止聚集进而提高量子产率，如采用屏蔽策略。屏蔽策略指的是添加一个官能团，使分子骨架扭曲，从而增加分子间空间位阻，减少分子内和分子间的相互作用，进而减少分子激发态向周围水分子的能量转移。Dai的研究小组首次引入了通过交替屏蔽单元、电子给体和受体设计的具有更高QY的NIR-II探针。噻吩及其衍生物EDOT近年来也常常用于探针的设计，可作为荧光团的第二给体以及桥接基团。值得注意的是，EDOT被证明在获得适当的分子畸变和基于屏蔽策略提高NIR-II荧光团的QYs方面优于噻吩。本文分别使用噻吩和EDOT作为第二给体和桥接分子来构建NT-1和NT-2荧光团。结果显示NT-2与EDOT在DCM中的QY为6.31%，比NT-1(Scheme 1)高1.8倍。
Scheme 1
另一种提高QY的创新策略是电荷屏蔽效应，即通过引入两性离子电荷来减少分子的净电荷。还可以通过疏水或疏水分支屏蔽荧光团的分子结构来减少荧光团与水分子之间的相互作用。本文在荧光团的设计中采用疏水受体（1,8-萘内酰亚胺）来达到上述目的。同时，1，8-萘内酰亚胺还可以有效地将荧光红移到NIR-II窗口。双键的增加也有利于π-共轭体系的拓展，本文通过增加桥联双键来进一步使荧光团的发射红移，并得到了荧光团NT-3和NT-4（Scheme 1）。
此外，构建高产、合成简单、副产物少的的NIR-II探针对于临床转化是很重要的。与以往报道的对称D-A-D NIR-II荧光团相比，本研究设计的NIR-II荧光团系列(NT-1、NT-2、NT-3、NT-4)的合成路线简单，产率超过90%，且具有不对称D-π-A结构。根据已有的报道，不对称结构的能量迁移是部分可逆的，这对于减少荧光团的光漂白有利。这也就进一步赋予分子恰当的灵活性和荧光强度/荧光持久范围，以更好地满足血管造影的需要，并提供更好的空间分辨率和对比度，以解决微血管分布和进行灌注分析。
基于分子设计策略和实验结果，NT-4被作为后续研究的候选物。为了提高其溶解度和细胞渗透性，进一步用TPGS（被FDA批准的具有抗氧化和抗炎作用）包封NT-4。TPGS使荧光团具有隐身效果。水中TPGS-NT-4 NPs的QY为3.46%，与已有报道的NIR-II探针的QY相比处于中上水平，满足NIR-II荧光成像的要求。体内血管造影实验显示，TPGS-NT-4 NPs是一种有效的NIR-II成像探针。尾静脉注射TPGS-NT-4 NPs后，裸鼠后肢血管的高斯半峰宽度(FWHM)为495 μm，滤光率为1300 LP, SBR为2.57。此外，通过右股动脉局部注射TPGS-NT-4 NPs可以很好地显示肿瘤血管。
毫无疑问，将纳米药物有效地输送到肿瘤组织，同时减少对正常组织的损伤是一项艰巨的挑战。本研究通过结合血管造影和局部光热治疗来提高纳米光热剂对肿瘤的吸收，同时减少其对正常组织的损伤。在NIR-II荧光引导下局部注射TPGS-NT-4治疗剂量，然后进行光热治疗。在辐照期间产生的健康组织损伤将大大减少。H&E染色证实了TPGS-NT-4 NPs具有良好的生物相容性。随后，本文还研究了TPGS-NT-4 NPs的光热性质。实验结果证实TPGS-NT-4 NPs具有良好的光热隔热性能和优异的光热稳定性。体内光热治疗实验也进一步证实TPGS-NT-4 NPs具有开发用于局部治疗的光热剂的潜力。
实验内容：
1）探针的合成、表征及光学性质研究
通过选择低电子密度受体(化合物10)和高电子密度给体(4-乙基- N, N -二甲基苯胺)，并以噻吩为桥接结构，设计了探针NT-1的不对称D-A结构。NT-1的合成通过一个简单的过程完成(图1A)。合成反应的产率为92%，与目前报道的NIR-II荧光探针相比，收率非常高。根据已报道的研究，采用屏蔽策略可以有效地提高NIR-II探针的QYs，这是由于共轭主链阻碍了分子间相互作用或阻止了聚集。据此，本文设计并合成了以EDOT取代噻吩的NT-2。EDOT作为第二给体和桥接基团具有扭曲分子骨架的作用，从而降低分子间的相互作用。NT-3和NT-4是通过延长双键来获得发射波长的红移而得到的。NT-2、NT-3、NT-4的收率也较高，分别为92%、90%、91%。用1H NMR、13C NMR和质谱对这4个化合物进行了表征，证实了结构的正确性。
Figure 1
对NT-1、NT-2、NT-3和NT-4的光学性质进行深入的研究。如图1A-D所示，四种小分子化合物在近红外窗口均有吸收，四种化合物在DCM中的最大吸收波长分别为840、860、880和915 nm。此外，随着溶剂极性的增加，四种探针的紫外-可见吸光度都出现了显著的蓝移效应。有趣的是，在含有10% DMSO的水溶液中，这四种化合物的吸收都蓝移到约650 nm。推测光谱蓝移是由于这四种化合物的水溶性差，它们都是大的共轭体系，聚集在极性溶剂中。
随后，在808 nm光激发下，四种探针的荧光发射都在NIR-II窗口，特别是在DCM和DMSO中(图1E-H)。四种化合物单体的最大荧光发射波长分别在1095、1050、1130和1110 nm处，而探针的低聚物在1200 nm处有一个肩峰。具有大斯托克斯位移的探针在生物成像中具有更高的信噪比(SBR)，四种化合物的Stokes位移分别为287、242、322和302 nm。本文还简要分析了四种分子结构的LUMO和HOMO轨道。四种探针的HOMOs均沿共轭主链离域，而LUMOs主要位于受体上。与NT-1和NT-3相比，含有EDOT的探针(NT-2和NT-4)表现出较少的离域LUMOs，并且可以调节静电势能的分布(图1B)。比较NT-2和NT-4，NT-4的双键延伸后吸收能降低，因此其吸收有明显的红移趋势，这与实验结果一致。以IR-26在1,2-二氯乙烷(DCE)中的含量为基准，计算了四种探针的相对QY。NT-1、NT-2、NT-3和NT-4在DCM中的QY分别为3.48%、6.31%、2.75%和4.08%。值得注意的是，在相同的测试条件下，由于引入了EDOT, NT-2和NT-4的荧光强度要高于NT-1和NT-3。产生这种实验现象的原因可能是由于EDOT的扭曲结构减少了分子间的相互作用。基于四种探针的光学性质，本文选择NT-4作为研究对象，对这种结构不对称的NIR-II探针进行进一步的修饰和研究，得到TPGS-NT-4 NPs，其荧光量子产率处于中等以上水平。
2）TPGS-NT-4 NPs的制备、表征及性能研究
由于NT-4的水溶性较差，选择两亲性生物材料D-α-生育酚基聚乙二醇琥珀酸酯(TPGS)对探针进行包封，使其具有生物学应用价值。通过薄膜水合法制备了负载NT-4的纳米颗粒(TPGS-NT-4 NPs)，并通过透析去除未包封的NT-4。接着对TPGS-NT-4的结构进行了表征，并对其理化性质进行了研究。如图2A所示，TPGS-NT-4 NPs的粒径约为15.37 nm，纳米颗粒呈电中性。通过透射电镜(TEM)表征了TPGS-NT-4 NPs的形态和大小。纳米颗粒呈球形，具有光滑均匀的形貌(图2D)。TPGS-NT-4 NPs的最大紫外可见吸收波长为805 nm。图2B显示，TPGS-NT-4 NPs与NT-4在DMSO中的紫外-可见吸收相似。这一实验现象证明，TPGS的包封显著提高了NT-4的水溶性。TPGS-NT-4 NPs的纳米包封率为84%。TPGS-NT-4 NPs的最大荧光波长为1020 nm，以IR-26为标准测定的QY为3.46%(图2C)。TPGS-NT-4 NPs的Stokes位移为212 nm。同时，对纳米颗粒的稳定性进行了研究。如图2E和F所示，室温下放置15天后，TPGS-NT-4 NPs的溶液状态、紫外可见吸收光谱和纳米颗粒大小均无显著差异，表明TPGS-NT-4 NPs在室温下具有良好的稳定性。
Figure 2
3）TPGS-NT-4 NPs的NIR-II血管成像研究
首先，通过MTT实验证实了NT-4和TPGS-NT-4 NPs在高浓度下对细胞没有毒性。为了证明TPGS-NT-4 NPs可以作为一种新的NIR-II探针用于全身血管成像，对Balb/c裸鼠进行全身和脑血管成像。裸鼠静脉注射TPGS-NT-4 NPs (200 μL, 0.5 mg/mL) (n = 3)。采用不同滤光片(900 LP、1000 LP、1100 LP、1300 LP)，通过InGaAs相机记录裸鼠NIR-II图像。注射TPGS-NT-4 NPs后10分钟显示NIR-II血管成像。为了更好地评价TPGS-NT-4 NPs血管成像效果，本研究选择对腿部血管进行局部血管成像。如图3A和B所示，在相同的曝光时间(400 MS)下，TPGS-NT-4 NPs在NIR-II窗口1300 LP下的成像分辨率更高。同时，对高斯半频全宽(FWHM)和信噪比(SBR)进行分析。当滤波器为1100 LP时，后肢血管的FWHM为643 μm，而当滤波器为1300 LP时，后肢血管的FWHM为495 μm(图3C和D)。此外，当滤波器为1300 LP时，SBR为2.57，显著高于滤波器为1100 LP时的1.53。随后，在与腿部血管相似的条件下对裸鼠的脑血管进行成像(图3E和F)。如图3G和H所示，FWHM分别为936 μm (1100 LP)和608 μm (1300 LP)。SBR分别为1.42 (1100 LP)和2.43 (1300 LP)。TPGS-NT-4 NPs在注射后24 h左右被完全代谢。注射TPGS-NT-4 NPs后24 h，对裸鼠(n = 3)进行安乐死和解剖，H&E染色分析不同脏器。H&E染色分析实验显示，经尾静脉注射TPGS-NT-4 NPs对裸鼠各脏器无明显损伤，证明TPGS-NT-4 NPs在体内具有良好的生物相容性。综上所述，所有实验结果表明，TPGS-NT-4 NPs可以作为NIR-II窗口体内血管成像的理想候选。
Figure 3
4）TPGS-NT-4 NPs光热性质研究
虽然NIR-II成像可以增加成像深度，但探针在NIR-II窗口内的QYs仍然较低。根据雅布隆斯基图理论，NIR-II探针返回基态所吸收的能量大部分以非辐射形式释放。本文研究了TPGS-NT-4 NPs的光热性质。在808 nm激光照射下，TPGS-NT-4 NPs的温度变化(ΔT)随着激光功率的增强而增大(图4A)。当激光功率密度为0.6 W/cm2时，温度变化可达33.2℃。同时，纳米颗粒的ΔT也随着浓度的增加呈增加趋势(图4B)。为了证明光热效应是由包封药物引起的，还研究了空壳纳米粒子(TPGS NPs)。如图4C所示，TPGS- NT -4 NPs的光热效应明显高于水和TPGS NPs。这些结果证明了NT-4包封探针产生的增温效应。同时，在相同光照条件下，NT-4在DMSO中的光热性质与TPGS-NT-4相似。NT-4的光热转化率为43%。红外热成像图像进一步证实了TPGS-NT-4 NPs良好的光热性能，如图4E所示。最后，对TPGS-NT-4 NPs的光热稳定性进行了监测。如图4D所示，TPGS-NT-4 NPs在90 min (808 nm, 0.6 W/cm2)内经历了三个光开关周期，而最高温度没有明显变化。计算TPGS-NT-4 NPs的光热转化率为45%。对比已报道的光热剂，TPGS-NT-4 NPs对NIR-II成像的光热转化率处于中上区间。由此可见，TPGS-NT-4 NPs具有优异的光热性能，有望开发为光热治疗剂。
Figure 4
5）TPGS-NT-4 NPs光热处理效果的体内评价
建立4T1肿瘤小鼠模型，来评价TPGS-NT-4 NPs作为光热剂的治疗作用。肿瘤生长后，将实验小鼠随机分为4组:对照组、PBS加激光组、TPGS加激光组、TPGS- NT -4 NPs加激光组(n = 3)。本文设计了一种局部光热治疗联合血管造影的方法，旨在提高TPGS-NT-4 NPs的肿瘤摄取，同时最大限度地减少对正常组织的损伤。本动物实验流程如图5A所示。首先，局部注射TPGS-NT-4 NPs (30 μL, 0.1 mg/mL)至肿瘤附近血管。注射后10分钟，在近红外二区对小鼠局部血管进行成像。如图5A所示，局部注射部位(红圈标记)血管亮度显著，肿瘤(蓝圈标记)也呈现荧光。这些结果表明，TPGS-NT-4 NPs通过血管向肿瘤方向积累。然后对小鼠进行光热治疗(PTT)，获得小鼠的红外热像图(图5B)，注射TPGS-NT-4 NPs并进行808 nm激光照射的小鼠，肿瘤区域温度明显升高，照射10 min后达到54.7°C的峰值，而注射纳米壳或水的小鼠未观察到明显的加热。随后，对4T1肿瘤小鼠进行10分钟的激光照射。然后每2 d记录不同治疗组小鼠的体重和肿瘤大小，连续14 d。与对照组、激光照射PBS和激光照射TPGS相比，注射TPGS- NT -4 NPs小鼠的肿瘤明显缩小(图5C)。为了观察治疗后肿瘤的差异，不同治疗组的小鼠在治疗周期结束时被安乐死并解剖。图5E显示，经TPGS-NT-4 NPs治疗后，肿瘤明显缩小甚至消失。同时，在治疗期间，相应组小鼠的体重没有显著差异(图5D)。不同组肿瘤的TUNNEL染色分析也显示，激光照射后TPGS-NT-4 NPs在组织水平上具有肿瘤杀伤作用(图5F)。这些结果表明TPGS-NT-4 NPs具有出色的光热处理效果。
Figure 5
结论：本文报道了一系列具有不对称D-A结构的新型NIR-II探针(NT-1, NT-2, NT-3和NT-4)。利用噻吩结构作为π桥合成了NT-1探针。基于用EDOT代替噻吩的屏蔽策略设计了NT-2。由于EDOT能够扭曲主链的偶联以及阻止分子间和分子内的相互作用，NT-2的QY显著增加，约为NT-1的1.8倍。进一步扩展NT-1和NT-2，得到了发射波长红移的探针(NT-3和NT-4)。结果表明，NT-1、NT-2、NT-3和NT-4具有高QY和大Stokes位移等优异的光学性能。此外，与报道的NIR-II探针相比，这四种探针的另一个优点是合成过程简单，产率高达90%左右。随后，本研究选择NT-4进行修饰和制备纳米颗粒(TPGS-NT-4 NPs)。体内血管造影实验显示TPGS-NT-4 NPs在1300 LP下具有较高的分辨率和SBR，证明TPGS-NT-4 NPs具有高分辨率的NIR-II成像引导血管造影的能力。NT-1、NT-2、NT-3和NT-4不仅扩展了不对称NIR-II探针的文库，而且其简单的合成和显著的NIR-II成像特性也有利于它们的商业或临床转化。此外，TPGS-NT-4 NPs具有良好的光热性能。基于局部递送和治疗的优势，在808 nm激光照射下局部注射TPGS-NT-4 NPs并血管造影后，肿瘤缩小甚至消融。局部光热疗法联合血管造影可以进一步增加肿瘤摄取，同时减少对正常组织的损伤。这些实验结果进一步表明，TPGS-NT-4 NPs有望成为血管造影和局部光热成像的有效药物。
参考文献
Li, L., Ma, X., Peng, Y., Yin, J., Guissi, N. E. I., & Wang, Y. (2023). Bright Asymmetric Shielding Strategy-Based NIR-II Probes for Angiography and Localized Photothermal Therapy. ACS Appl Bio Mater, 6(4), 1639-1649.
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