本文要点：一个多世纪以来，肿瘤切除手术一直依赖医生的视觉反馈和经验来识别恶性组织和健康组织之间的边界，这容易留下残留癌细胞或者会过度移除健康组织。在根治性前列腺切除术、胰十二指肠切除术、乳腺癌和高级胶质瘤切除术中有8%-70%的病例出现肿瘤残留，导致局部癌症复发。MRI、CT或X射线可用于改善术前成像，但不适用于术中实时导航，所以需要一种可用于术中且可在少数细胞水平切除残留肿瘤的高空间分辨率成像方式。

本文中作者开发了一种小型成像仪，用于同时进行可见光下摄影和NIR-II荧光成像，用于临床上成像引导手术。同时利用在NIR -IIb区发光的具有生物相容性的铒元素稀土纳米颗粒（ErNPs），它连接上TRC105抗体后，用于4T1小鼠乳腺肿瘤中CD105（内皮糖蛋白）血管生成标记物的分子成像。此成像方式可清晰地分辨肿瘤边缘以及少量残留癌细胞，从而实现在少数细胞水平上彻底且非过度地切除肿瘤。

作者集成使用可见光摄影的彩色相机和NIR-II区相机，构建了一个便携式成像仪。这两台相机使用了两条由二向色镜隔开的成像路径，并共用相同的成像镜头组，以便于实时叠加摄影和荧光图像。具有连续可变放大倍数的可变焦镜头组用于大视场（FOV）成像，并可切换使用5倍物镜达到更高分辨率。808nm激光或940nm LED用于激发荧光。RGB-LED作为室内光线用于彩色成像，因为作者观察到RGB-LED对NIR-I和NIR-II荧光成像的影响可以忽略不计（图1A）。 

TRC105是一种人源化的处于临床阶段的单克隆抗体，可与内皮糖蛋白CD105结合，故可于高CD105表达的人类和小鼠肿瘤血管特异性结合。作者将TRC105分别与I期临床试验荧光团IRDye800CW和ErNPs结合，形成IRDye800抗体结合物（IRDye800-TRC105）和ErNPs抗体结合物（ErNPs-TRC105）（图1B）。IRDye800-TRC105作为对照物在NIR-I和NIRII成像，ErNPs-TRC105在NIR-IIb区成像（1500-1700nm），激发波长为940nm（图1C）。

在BALB/c小鼠的左后肢或右后肢接种4T1小鼠乳腺肿瘤后，待肿瘤达到一定大小，静脉注射IRDye800-TRC105或ErNPs-TRC105。IRDye800-TRC105在NIR-I区和NIR-IIa区成像，ErNPs-TRC105在NIR-IIb区成像。注射后10分钟，在小鼠全身观察到IRDye800-TRC105信号，而ErNPs-TRC105的信号集中在小鼠血管。随着时间的推移，IRDye800-TRC105和ErNPs-TRC105在4T1肿瘤中的荧光信号增加，表明探针可靶向肿瘤血管。24h后，ErNPs-TRC105的背景信号较IRDye800-TRC105低，SBR更高（图2AB）。ErNPs-TRC105的T/NT达到40，比IRDye800-TRC105的4.4（NIR-I）和5.9（NIR-II）高得多。为了进一步证明ErNPs高度特异肿瘤靶向性，作者将ErNPs-TRC105的静脉注射剂量降低了一个数量级，仍能在4T1肿瘤中获得良好的成像，T/NT仍能达到40（图2C）。

图2. （A）静脉注射IRDye800-TRC105（左和中）或ErNPs-TRC105（右）后不同时间点下携带4T1肿瘤的小鼠的荧光图像（B）沿A中虚线的归一化荧光强度分布 （C）各组T/NT比值

当接种在小鼠后肢的4T1肿瘤达到4到8mm，注射IRDye800-TRC105和ErNPs-TRC105后，作者进行成像下的肿瘤切除手术（图3A）。对于使用IRDye800-TRC105的影像引导手术，我们首先移除覆盖4T1肿瘤的皮肤，以暴露肿瘤和周围组织。肿瘤边缘在背景上清晰可见，但对比度较低。根据肿瘤和周围肌肉的荧光强度计算T/M为2.5和3.6，分别在NIR-I和NIR-II（图3C）。切除肿瘤之后，瘤床，皮肤和肌肉组织仍显示出较高的背景荧光发射，因此很难有把握辨别出肿瘤的残留物。

图3.（A）（上）手术期间记录的彩色图像。静脉注射IRDye800-TRC105 24小时后4T1肿瘤切除的NIR-I荧光成像（中）和NIR-II荧光成像（下）（B）沿图A中虚线的归一化荧光强度分布（C）NIR-I和NIR-II下Dye800-TRC105的T/M

对于ErNPs-TRC105进行类似的操作（图4A），其在NIR-IIb下成像的T/M为300（图4C），与IRDye800-TRC105的NIR-I和NIR-II成像相比，ErNPs-TRC105周围组织的荧光更低，肿瘤边缘的信号变化（接近零）更为剧烈，使得评估肿瘤边缘更容易（图4B）。作者有时会观察到ErNPs-TRC105在肿瘤周围区域的信号强于肿瘤中部区域，但不总是存在这种情况，荧光探针的分布可以反映出CD105在肿瘤上的表达位置（图4A）。肿瘤切除后，将肿瘤切片，经H&E染色和NIR-IIb成像，叠加两者图像显示，ErNPs-TRC105信号确实位于H&E染色的肿瘤区域，而在正常组织区域很少被检测到（图4D）。

图4. （A）手术期间记录的彩色图像（上）。静脉注射ErNPs-TRC105 24小时后4T1肿瘤切除的NIR-IIb荧光成像（中）和两者的重叠图像（下）（B）沿图A中虚线的归一化荧光强度分布（C）ErNPs和ErNPs-TRC105的T/M（D）肿瘤切片的H&E染色情况和NIR-IIb成像

作者使用了最高放大倍数的可变焦镜头组来检查与残余肿瘤病变相关的残余荧光信号（图5AB），在NIR-IIb窗口中观察到远高于边缘的荧光点。随后作者换用5倍物镜的高分辨率模式来检查，观察到含有数千个细胞的少量肿瘤残留物，尺寸在微米级别（图5CD）。在这种成像的指导下，作者切除了由ErNPs-TRC105标记的少量残留病变，直到在原始肿瘤区域中未观察到荧光信号（图5E）。

总的来说，作者研发了一台将可见光成像和NIR-IIb成像结合的成像仪器，利用连接了TRC105抗体的铒元素稀土纳米颗粒（ErNPs-TRC105），对小鼠的肿瘤进行NIR-IIb成像，相对于IRDye800CW可更清晰地显示肿瘤边缘。在ErNPs-TRC105的成像下还可实现在低细胞水平切除残留肿瘤组织，避免传统手术上肿瘤切除不完全的弊端。

图5. （A）（B）在可变焦镜头组的最高放大倍数下观察肿瘤初次切除后手术区域的彩色和NIR- IIb成像（C）5倍物镜下观察肿瘤初次切除后手术区域的彩色和NIR- IIb成像（D）C中沿虚线的归一化荧光强度分布，显示特征尺寸为38μm（E）切除肿瘤残余组织后的成像

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