本文要点：作者开发了一套新型双 NIR-IIb 比率荧光探针，能够在 1525 nm 发射两个波长相同的荧光信号，以808 nm 激发荧光为传感信号，980 nm 激发荧光为自校准信号，通过测量NIR-II 荧光比率信号(F_808ex/ F_980ex)获得了准确可靠的检测结果。在关节炎小鼠中给予探针后，根据比值信号对炎症部位的 ClO^-效应产生反应，区分炎症病变与周围的正常组织。此外，通过体内图像和体外检测曲线，可以准确计算病变中的表达 ClO^-量。考虑到双 NIR-IIb 比率荧光信号不受探针浓度和位置等各种干扰的影响，有望为生物医学研究和病理诊断提供一个无创、定量和可视化的平台。

图1. 在相同NIR-IIb波长下具有双发射的Dye@DSNPs的制备和表征

研究发现，在所有染料中，IR-808是对所制备的DSNPs最有效的敏化剂。在 808 nm激发下，IR-808 @DSNPs在 980 和 1525 nm 处表现出特征性的尖锐荧光峰，这可归因于 Yb³⁺离子的²F_5/2 → ²F_7/2跃迁和 Er³⁺离子的 ⁴I_13/2 → ⁴I_15/2 跃迁(图1f)。如图1h所示，吸收光谱结果表明 IR-808 可以赋予 IR808 @ DSNPs 高的 808 nm 光吸收，但在 980 nm 吸收时几乎可以忽略不计。IR-808介导的三重态敏化DSNPs在808或980nm激发下处理相同的NIR-IIb发射，用于开发具有相同双发射的比率荧光探针。

图2. IR-808 @ DSNPs@ DSPE-PEG-NH₂ 纳米探针，具有相同的 NIR-IIb 双发射

为了赋予用于生物研究的 IR-808 @ DSNPs 水溶性，使用两亲性分子 DSPE-PEG-NH₂封装 IR-808 @ DSNPs使它们在水溶液中可分散(图2a)。测得比值荧光信号(F_808ex/F_980ex)约为1，在PBS中保持稳定7天，无任何变化，有利于纳米探针的长期储存（图2g）。此外，获得的NIR-IIb比率荧光探针在1000μg/mL的高浓度下，对4T1乳腺癌症细胞和L929正常细胞基本无毒，具有生物应用的安全性（图2i）。

图3. 深度可调的1%脂肪乳剂覆盖的 IR-808 @DSNPs@ DSPE-PEG-NH₂的808/980 nm激发双NIR-IIb比率成像

如NIR-II 荧光图像所示，808 和980 nm 激发的荧光强度均随着穿透深度的增加而逐渐降低(图3 c，d)，但它们的 NIR-II 比率信号仍保持一致(图3 c，e)。这些结果表明，双 NIR-IIb 发射比率信号(F980ex/F808ex)与 1%脂肪乳的吸收和散射无关。因此IR-808 @DSNPs@ DSPE-PEG-NH₂是理想的比率型 NIR-IIb 荧光纳米探针。

图4. 不同ClO⁻浓度下IR-808 @DSNPs@ DSPE-PEG-NH₂的体外双NIR-IIb比率荧光成像

文献报道IR-808能够被 ClO^-特异性氧化，然而 808 nm 激发的 NIR-IIb 荧光是由 IR-808 介导的三重态敏化途径产生的，因此随着 ClO^-加入量的增加，Er³⁺离子的相应发射会逐渐下降(图4a)。相反，加入 ClO^-后，980 nm 激发的下移荧光可以独立保留。IR-808 @DSNPs@ DSPE-PEG-NH₂以808 nm 激发荧光为传感信号，980 nm 激发荧光为自校准信号，可用于ClO^-的定量检测(图4b)。绘制比率信号(F_808ex/ F_980ex)与 ClO^-浓度的相关图，得到了很强的线性相关性(R² = 0.998，图4e)。图4f表明，纳米探针只对 ClO^-有反应，而避免干扰其他类似的分析物，提供极高的灵敏度和选择性。

图5. 通过双 NIR-IIb 比率式纳米探针原位监测关节炎模型中的炎症

为了证明 NIR-IIb 比率荧光信号用于准确体内检测的有效性，在关节炎小鼠模型中使用IR-808 @DSNPs@ DSPE-PEG-NH₂ 对ClO^-进行可视化。使用公式R = 1.0017-0.0454c（其中R表示F_808ex/F_980ex的比值，c表示ClO^-的浓度，图4e）计算，得到炎症足中的 ClO^-量从 0.95μM升高到14.44μM (图5f)。因此，双NIR- IIb比率探针不仅能够识别炎症和正常组织，还能够实时定量测定体内的 ClO^- 量。

作者开发了一套新型双 NIR-IIb 比率荧光探针，用于基于分析物依赖性从染料到 DSNP 的三重态能量转移的体内检测。所制备的探针能够在 1525 nm 处发射两个具有相同波长的荧光信号，其中一个在 808 nm 处激发用于传感通道，而另一个在 980 nm 处激发用于参考通道。受益于消除组织中光传播路径的干扰，通过测量 NIR-II 荧光比例信号(F808ex/F980ex) 获得准确可靠的检测。在关节炎小鼠中施用探针后，考虑到比例信号可以对炎症部位的ClO−做出反应，通过激发的双 NIR-IIb 荧光成像可以直接将炎症病变与周围正常组织区分开来。此外，通过比较体内图像和体外检测曲线，可以准确计算病灶中表达的ClO−量。考虑到双 NIR-IIb 比率荧光信号独立于探针浓度和位置等各种干扰，有望为广泛的生物医学研究和病理诊断提供无创、定量和可视化平台。

参考文献

Wang, X.; Li, M.; Zheng, X.; Sun, B.; Wang, Y.; Xu, J.; Han, T.; Ma, S.; Zhu, S.; Zhang, S., Dye-Triplet-Sensitized Downshifting Nanoprobes with Ratiometric Dual-NIR-IIb Emission for Accurate In Vivo Detection. Analytical Chemistry 2023, 95 (41), 15264-15275.

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