本文要点：作者设计并研制了 D-π-A-π-D 型有机小分子荧光团 CED，并将其与 DSPE-mPEG₂₀₀₀ 包裹在水溶性纳米粒子中，合成了一种明亮的 NIR-II 纳米荧光团(CED NPs)。CED NPs 可安全、无创、灵敏、快速地用于体内荧光成像。

生物学实验表明，小鼠尾静脉注射后可立即检测到体内强荧光信号。在裸鼠皮下肿瘤模型中，CED NPs 可富集于裸鼠肿瘤部位，并通过血液循环和 EPR 效应呈现肿瘤轮廓。在转移性裸鼠模型中，CED NPs 可标记裸鼠受癌细胞侵袭的淋巴结，并通过荧光成像指导手术切除(图 1)。

图1. CED NPs制备及动物实验示意图

图2. CED的特性

为了使CED 分子具有更好的生物应用，将CED 分子中的醛基与 NH₂-PEG 发生希夫碱反应，通过引入 PEG 基团提高了 CED 分子的水溶性（图 2e）。为了避免聚集荧光淬灭和减弱 CED 分子之间的相互作用，CED 被DSPE- mPEG₂₀₀₀ 包封，制备成纳米颗粒（CED NPs）。通过改进和表征 CED 的疏水性，认为 CED NPs 的形态、粒度和水溶性可以满足下一步实验的要求。

图3. CED NPs的荧光特性

在CED NPs水溶液中，通过紫外-可见-近红外分光光度计法测得CED NPs的最大吸收峰在725 nm处（图3a）。CED NPs水溶液的最大荧光发射峰可达1025 nm(图3b)。图3c显示了CED NPs在3种溶液中均表现出良好的荧光稳定性。使用 IR-26 作为标准样品计算了 CED NPs 的荧光量子产率 (QY)，计算得到 QY_IR-26 =0.50%，QY _{CED NPs}=1.15%。

图4. CED NPs的细胞毒性特征

为满足生物安全要求，采用 MTT 法对 CED NPs 的毒性进行表征。检测3T3细胞（图4a） 929 细胞（图4b）和 4T1 癌细胞(图4c)的毒性，实验结果表明，CED NPs 对正常细胞的毒性略强于癌细胞，推测胞吐和癌细胞的增殖能力可能会干扰毒性实验。作者还通过细胞活力染色实验验证了CED NPs 对正常细胞3T3的细胞毒性，结果显示不同浓度下的活细胞数差异不大，表明 CED NPs 毒性较小。综上所述，CED NPs 具有良好的生物安全性，可进一步用于体内实验。

图5. CED NPs体内荧光特性的表征

尾静脉注射CED NPs后，小鼠体内可立即观察到荧光信号(图5a)，在约5分钟内可清楚地观察到小鼠的主要血管和一些淋巴结。对照组注射DSPE-mPEG2000后，成像系统未观察到荧光(图 5b)。注射CED NPs 24h后，解剖正常裸鼠，对主要器官进行荧光成像，结果荧光信号主要集中在肝脏，在脾脏也有少量信号，心脏、肺或肾脏中无荧光信号。通过组织切片可见，CED NPs 注射 24 h 后，裸鼠主要器官未见明显异常、炎症或病变。因此，CED NPs 具有良好的生物相容性，且对裸鼠脏器无损伤。

图6. 裸鼠转移性肿瘤的荧光特性

为实现体内肿瘤显像，本研究选择免疫缺陷的裸鼠为机体，4T1 细胞为肿瘤细胞来源，建立转移性肿瘤模型。CED NPs 可通过血液循环被动地靶向转移性肿瘤裸鼠中被癌细胞侵袭的淋巴结，从而点亮全身更多的淋巴结。因此，CED NPs 可用于标记裸鼠中肿胀的淋巴结，用于检测转移性肿瘤。

在本研究中，作者使用D-A-D结构作为有机小分子探针的基本骨架，引入EDOT作为受体和供体之间的π-键延伸共轭结构，并设计和合成了具有更大共轭结构的小分子荧光团。为了避免共轭分子之间的相互作用导致荧光猝灭，研究者在共轭分子的主链上引入长链烷基作为弱分子间力的屏蔽单元。其次，为了提高CED分子的水溶性，减少聚集荧光的影响，我们用脂质体包封了它。CED纳米粒子在体内表现出优异的荧光特性和生物安全性，可以清晰灵敏地标记皮下荷瘤裸鼠的肿瘤位置和轮廓，并可用于标记无定向肿瘤裸鼠的肿大淋巴结，为荧光成像指导临床手术提供了清晰的视觉视角。

总之，NIR-II有机小分子荧光探针是一种非常有前途的造影剂。利用有机分子结构的易调谐特性，不断改进小分子探针和供体-受体组合的结构，设计和合成更完美的荧光基团，加速临床转化，从而极大地促进了医学成像的发展。

参考文献

Yuan, L.; Su, Y.; Zhang, R.; Gao, J.; Yu, B.; Cong, H.; Shen, Y., NIR-II organic small molecule probe for labeling lymph nodes and guiding tumor imaging. Talanta 2024, 266.