作者首先将IR780和IR1048作为纳米颗粒核心的备选分子，选用了一系列两亲性多聚物来封装IR780（图1a）和IR1048（图1e），以改善它们在H₂O中的光学性质和对HClO的化学稳定性。其中，PSMA@IR780 NP在加入HClO后780nm处的吸光度没有显著变化，显示出较好的稳定性（图1b, c），这可能归因于其相对较低的ζ电位（图1d），导致纳米颗粒和HClO间产生强烈的静电排斥。在多聚物结合IR1048所得的纳米颗粒中，DSPE-PEG@IR1048 NP和PSMA@IR1048 NP的吸收光谱具有1048nm的特征峰，证实IR1048可以成功地结合到DSPE-PEG和PSMA中，而其余纳米颗粒在1048nm处的吸光度可忽略不计（图1f）。调整IR1048 NP中PSMA和DSPE-PEG的比例，发现随着PSMA的百分比从0%增加到100%，在H₂O中其NIR-II荧光强度逐渐增加（图1g），对HClO的稳定性也不断增加（图1h），ζ电位逐渐降低（图1i）。这表明PSMA可以提高IR1048在水溶液中的荧光强度和化学稳定性。因此，选择PSMA@IR1048NP进行表征和后续成像实验。

PSMA@IR1048 NP可以很好地分散在水中，在透射电子显微镜下呈直径约30nm的球形（图1j）。在水中显示出明亮稳定的NIR-II荧光，强度高于H₂O或MeOH中的游离IR1048染料（图1k）。在与不同活性物质孵育后，其吸光度和荧光没有明显变化，表现出良好的稳定性（图1l, m）。

图1.（a）两亲性聚合物和IR780的化学结构。两亲性聚合物@IR780 NPs的一步自组装。游离染料IR780和用不同两亲性聚合物修饰的IR780在与HClO孵育之前（b）和之后（c）的吸收光谱。（d）用不同两亲性聚合物修饰的IR780的ζ电位。（e）两亲性聚合物@IR1048 NPs的一步自组装。（f）不同两亲性聚合物修饰的IR1048的吸收光谱。（g）不同PSMA和DSPE-PEG比例的两亲性聚合物@IR1048 NPs的荧光强度。插图：纳米颗粒相应的荧光图像。（h）不同PSMA和DSPE-PEG比例的两亲性聚合物@IR1048 NPs在与HClO孵育前后的1048nm处的吸光度。（i）用不同比例的PSMA和DSPE-PEG修饰的IR1048的ζ电位。（j）PSMA@IR1048 NPs在H₂O中的透射电子显微镜（TEM）图像。（k）IR1048在H₂O、MeOH中和PSMA@IR1048 NPs在H₂O中的NIR-II（1100-1700 nm）荧光对比。PSMA@IR1048 NPs在PBS中与各种活性物质孵育后的的吸收（l）和荧光（m）光谱。1：PBS；2：¹O₂（50μmol/L）；3：Cys（50μmol/L）；4：GSH（50μmol/L）；5：H₂O₂（50μmol/L）；6：·O₂⁻（50μmol/L）；7：·OH（50μmol/L）；8：ONOO⁻（20μmol/L）；9：HClO（20μmol/L）。激发波长：980nm。

接下来，将一系列菁基荧光团负载在PSMA@IR1048 NP上，构建比率型NIR-II探针RNP（图2a, e, i）。相较于游离菁基染料，RNP由于其在水溶液中的溶解度得到改善，表现出更明显的氰基荧光团特征吸收峰（780nm）和强荧光发射（820nm）（图2b, f, j）。RNP的化学稳定性与所负载的菁基染料的电荷有关。携带+1净电荷的IR780分子静电吸附增强，从而显著提高其化学稳定性，加入活性物质后吸光度和荧光几乎恒定。而IR775S和IR796带有0和−1的净电荷，静电吸附减弱，使它们更容易被活性物质破坏（图2c, g, k）。值得注意的是，RNP2在加入HClO后吸光度急剧下降，而对其他活性物质有较好的稳定性，这成为构建比率型荧光纳米探针的基础。此外，RNP的光稳定性也得到改善（图2d、h、l）。

图2. NIR-II比率荧光纳米探针RNP1（a）、RNP2（e）、RNP3（i）的构建。（b）IR780和RNP1在H₂O中的荧光光谱。（f）IR775S和RNP2在H₂O中的荧光光谱。（j）IR796和RNP3在H₂O中的荧光光谱。RNP1（c）、RNP2（g）、RNP3（k）与各种活性物质孵育后的吸收光谱。RNP1（d）、RNP2（h）、RNP3（l）在808nm激光（180s，200mW/cm²）下的吸收光谱。

如图3a，RNP2表面的IR775S在HClO存在时显示出“关闭”NIR-II荧光（FL1，激发波长808nm），同时核心中的IR1048对HClO足够稳定，因此提供了稳定的NIR-II输出信号（FL2，激发波长980nm）。RNP2在水溶液中分散性良好，呈球形（~30nm）（图3b）。

接着调节HClO浓度验证RNP2对HClO的响应特性。检测吸收光谱发现，随HClO浓度从0增加到20μmol/L，RNP2在约780nm处的吸光度逐渐降低，而IR1048特征吸收峰的变化可忽略（图3c）。荧光光谱也显示，IR775S的特征峰（~820nm）随HClO的浓度增加不断降低，而IR1048峰无显著变化（图3e, f）。将FL2荧光图像除以FL1图像来进一步构造比率图像（FL2/FL1），发现RNP2的FL2/FL1比率随HClO浓度的升高而逐渐增加（图3d, g）。相较于其他活性物质，在HClO存在时的FL2/FL1比例提高了约30倍，表明RNP2对HClO具有优异的特异性（图3h, i）。

图3.（a）用于HClO比率荧光成像的RNP2方案。（b）RNP2的代表性TEM图像。（c）RNP2与0–20μmol/L HClO孵育后的吸收光谱。（d）在与不同浓度的HClO孵育后，RNP2的FL1（激发波长：808nm，发射波长：1100-1700nm）、FL2（激发波长：980nm，发射波长：1100-1700nm）和FL2/FL1的荧光图像。（e）RNP2与不同浓度的HClO孵育后的荧光光谱。激发波长：740和980nm。（f）RNP2在820nm处的荧光与（e）中的HClO浓度之间的线性关系。（g）在用（e）中不同浓度的HClO孵育后RNP2的FL2/FL1的定量。（h）选择性反应：与不同活性物质孵育后，RNP2的FL1、FL2和FL2/FL1的荧光图像。1：PBS；2：¹O₂（50μmol/L）；3：Cys（50μmol/L）；4：GSH（50μmol/L）；5：H₂O₂（50μmol/L）；6：·O₂⁻（50μmol/L）；7：·OH（50μmol/L）；8：ONOO⁻（20μmol/L）；9：HClO（20μmol/L）。激发波长：808和980 nm，发射：1100–1700 nm。（i）与不同活性物质孵育后RNP2的归一化FL2/FL1比率。

糖尿病是一种以血糖水平升高为特征的代谢紊乱。在高血糖状态下，肝脏葡萄糖异常升高，其氧化磷酸化会导致ROS过度产生，而ROS在糖尿病的进展和发展中起到重要的作用。因此，实时检测HClO水平对于糖尿病的辅助诊断非常重要。受RNP2对HClO具有良好选择性的启发，作者进一步使用RNP2对糖尿病小鼠的HClO水平进行实时成像。

注射生理盐水的小鼠为健康小鼠（第1组）；腹膜内注射链脲佐菌素以获得糖尿病小鼠（2-4组）；用二甲双胍治疗糖尿病小鼠，以缓解糖尿病期间的氧化应激（第5组）。（图4a）。可见第2-4组的小鼠体重逐渐下降（图4b），其中第4组的血糖水平显著升高（图4c）。荧光成像结果显示，第1、5组显示出强烈的FL1荧光，而第2-4组FL1的荧光强度逐渐降低（图4d, e）。且从第1组到第4组，FL2/FL1的比率显著增加（图4f），表明随着糖尿病的持续进展，HClO水平升高。结合检测时间可知，基于RNP2的比率荧光成像能够比体重变化早至少1天检测出链脲佐菌素诱导的糖尿病，比血糖测定早至少6天检测出糖尿病。

作者还研究了糖尿病与肝损伤之间的关系，发现糖尿病过程导致血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）和天冬氨酸转氨酶（AST）显著增强（图4g, h）。肝脏组织学分析结果也显示，与健康小鼠和治疗组相比，在不同进展的糖尿病小鼠中观察到炎性细胞浸润和空泡变性，并且晚期糖尿病小鼠的损伤比早期糖尿病小鼠更严重（图4i），证明肝损伤与糖尿病之间存在积极关系。

图4.（a）RNP2用于糖尿病小鼠成像和给药程序的方案。（b）糖尿病小鼠在不同时间点的相对体重。（c）1-4组小鼠的血糖浓度（ns：无显著差异，****：P<0.0001，ANOVA）。当平均血糖浓度被确定为大于11.1mmol/L时，认为小鼠中已经发生糖尿病。（d）静脉注射RNP2 10分钟后，1-5组小鼠的FL1、FL2和比率FL2/FL1图像。FL1激发波长：808 nm，FL2激发波长：980 nm。发射波长：1100-1700 nm。黄色曲线表示肝脏区域。（e, f）静脉注射RNP2 10分钟后，第1-5组小鼠的归一化FL1、FL2和FL2/FL1比率的量化。（g, h）1-5组小鼠的ALT和AST浓度。（i）1-5组小鼠肝脏的代表性H&E染色切片。

下肢I/R损伤是骨科手术中常见的主要并发症，通常伴有过表达的ROS水平。及时测量升高的ROS水平对检测I/R损伤程度具有重要意义。因此将RNP2用于对I/R损伤模型中的实时HClO水平进行成像。

小鼠右大腿接受短缺血（30分钟）或长缺血（60分钟），假手术组（左大腿）作为对照组，然后均再灌注90分钟，并腹腔注射RNP2，然后进行NIR-II成像（图5a）。在注射RNP2后0、60和90分钟，假手术组的下肢区域显示出FL1和FL2强荧光，而缺血组显示出弱FL1荧光（图5b-d）。其中，长缺血组由于HClO量较高且损伤严重，比短缺血组表现出更低的FL1强度和更高的FL2/FL1比率。

此外，对这些小鼠的下肢切片进行了组织学分析（图5e）。与假手术组相比，在I/R损伤区域可观察到炎症细胞浸润，并且长缺血小鼠（60分钟）的损伤比短缺血小鼠（30分钟）的更严重，表明I/R过程对小鼠的严重损伤。

总之，本研究开发了一种简易的分子工程策略来构建基于菁的NIR-II比率成像纳米平台，并且成功开发了一种电荷调制策略，以调节纳米颗粒对活性物质的反应性，赋予其特定的HClO响应性能。所制备的RNP2可以避免疾病部位其他活性物质的干扰，从而可靠地检测HClO的病理水平，显示了基于菁基的纳米探针在特定疾病的NIR-II荧光成像中的良好潜力，该策略可能为设计其他明亮稳定的NIR-II纳米探针及其生物应用提供见解。

参考文献

Ma, Y.; Liu, L.; Ye, Z.; Xu, L.; Li, Y.; Liu, S.; Song, G.; Zhang, X.-B., Engineering of cyanine-based nanoplatform with tunable response toward reactive species for ratiometric NIR-II fluorescent imaging in mice. Science Bulletin 2023.

⭐️ ⭐️ ⭐️

近红外二区小动物活体荧光成像系统 - MARS 

NIR-II in vivo imaging system

高灵敏度 - 采用Princeton Instruments深制冷相机，活体穿透深度高于15mm

高分辨率 - 定制高分辨大光圈红外镜头，空间分辨率优于3um

荧光寿命 - 分辨率优于 5us

高速采集 - 速度优于1000fps （帧每秒）

多模态系统 - 可扩展X射线辐照、荧光寿命、一区荧光成像、原位成像光谱，CT等

显微镜 - 近红外二区高分辨显微系统，兼容成像型光谱仪

有不同型号的样机可以测试，请联系：

艾中凯(博士)

132 6299 1861

⭐️ ⭐️ ⭐️

 恒光智影

          上海恒光智影医疗科技有限公司，被评为“国家高新技术企业”，上海市“科技创新行动计划”科学仪器领域立项单位。

          恒光智影，致力于为生物医学、临床前和临床应用等相关领域的研究提供先进的、一体化的成像解决方案。

          与基于可见光/近红外一区的传统荧光成像技术相比，我们的技术侧重于近红外二区范围并整合CT, X-ray，超声，光声成像技术。

          可为肿瘤药理、神经药理、心血管药理、大分子药代动力学等一系列学科的科研人员提供清晰的成像效果，为用户提供前沿的生物医药与科学仪器服务。

⭐️ ⭐️ ⭐️

上海恒光智影医疗科技有限公司

地址：上海市浦东新区张江高科碧波路456号 B403-3室

网址：www.atmsii.com

邮箱：ai@atmsii.com

电话：132 6299 1861 （同微信）

👇关注我们，查看更多近红外二区活体成像应用案例👇