引言：结直肠癌是目前世界上第三致命的癌症。与传统的宽光筛查内窥镜检查相比，基于分子探针的近红外-II (NIR-II)荧光成像能够有效识别病变靶点，提高图像对比度，提高早期肿瘤检出率。c-Met在CRC晚期过度表达，是一种肿瘤生物标志物。在此，基于克唑替尼（Crizotinib）对c-Met阳性肿瘤细胞的良好靶向抑制作用，染料IR808与药物分子Crizotinib共价结合，从而合成了靶向c-Met阳性肿瘤细胞的近红外荧光探针Crizotinib-IR808。然后，水不溶性Crizotinib-IR808与具有生物相容性和生物安全性良好的牛血清白蛋白纳米粒子(BSA NPs)制备了 Crizotinib-IR808@BSA NPs。Crizotinib-IR808@BSA NPs具有肿瘤靶向能力，可用于无创生物医学血管NIR-II成像和术中实时NIR-II成像，以指导肿瘤切除。在808 nm激光照射下，Crizotinib-IR808 @ BSA NPs对肿瘤表现出协同光疗效应。总之，这种创新的影像介导的多功能联合治疗策略具有良好的c-Met靶向能力，可能成为一种新的治疗结直肠癌的方法。
研究内容：作者设计并合成一种Crizotinib-IR808偶合物，以研究其在结直肠癌中的NIR-II成像引导的协同化学光疗。选择Crizotinib的哌啶胺作为IR808的连接子，因为该区域暴露于与Crizotinib共结晶的c-Met晶体结构中的溶剂区域。根据预测，该区域的化学变化对Crizotinib与c-Met 的ATP结合口袋中的关键残基的相互作用几乎没有影响，从而保持了药物-染料偶联物的效力。然后，使用具有高稳定性、非抗原性和生物安全性的牛血清白蛋白纳米粒子制备Crizotinib-IR808 @ BSA NPs。将制备的Crizotinib-IR808 @ BSA NPs用于肿瘤NIR-II成像以及术中NIR-II成像引导的肿瘤切除。此外，还研究了Crizotinib-IR808 @ BSA NPs用于化疗协同PDT和PTT的肿瘤消除。
图1. Crizotinib-IR808@BSA的特性 (A) TEM图像 (B)流体动力学粒径和(C)ζ电势。(D) Crizotinib -IR808和Crizotinib -IR808@BSA的吸收光谱和(E)近红外荧光发射光谱(6μm)。(F)在不同溶剂中的NIR-II荧光图像。(G) Crizotinib-IR808与BSA的分子对接(PDB ID: 6QS9)。(H)Crizotinib-IR808在含有白蛋白结合位点I、II、III和α1-羟基脂肪蛋白抑制剂的BSA水溶液中的归一化发射强度。
TEM图像显示，Crizotinib-IR808 @ BSA NPs呈球形，在水溶液中均匀分布，直径为128.8 ± 9.4 nm。DLS实验表明，平均水合直径为156.3 nm，与TEM的结果相符。与BSA相比，Crizotinib-IR808@BSA NPs的ζ电势向正方向移动了-5.2mV。紫外-可见吸收光谱显示，水中的Crizotinib-IR808 @ BSA NPs在778 nm处出现明显的吸收峰，与DMSO中的Crizotinib-IR808相似，比水中的游离Crizotinib-IR808悬浮液的吸收峰更尖锐。通过光稳定性实验得出Crizotinib-IR808@BSA NPs的光稳定性强于Crizotinib-IR808，证明BSA NPs是防止Crizotinib-IR808在水中聚集或水解的有效方法。使用先前报道的方法，作者更详细地评估了Crizotinib-IR808的BSA结合位点。白蛋白结合位点I、II、III和1-羟基糖脂蛋白的抑制剂分别是华法林、布洛芬、地高辛和奎尼啶，发现华法林能够显著降低荧光，表明对白蛋白Sudlow位点I具有高亲和力。
图2. 体外光热效应和ROS生成 (A)不同梯度浓度和(B)不同辐照强度下的实时红外热像图和温度变化曲线。(C)光热转换效率 (D)光热稳定性。(E)用Crizotinib-IR808@BSA进行DPBF预培养的吸收光谱。(F)在DMSO中用不同辐射强度的Crizotinib-IR808@BSA进行DPBF预培养的相对吸光度。
首选研究了Crizotinib-IR808@BSA NPs的光转化能力，得出其温度升高与浓度和激光强度有关。与临床常用的光敏剂ICG相比，Crizotinib-IR808@BSA NPs有更好的PCE。为了研究光稳定性，通过五次激光ON/OFF加热循环，Crizotinib-IR808@BSA NPs光热性能几乎不变。然后研究了 Crizotinib-IR808 和 1O2 探针 DPBF 混合物的紫外可见光谱，以确定产生 ROS 的能力。发现在 Crizotinib-IR808@BSA NPs 的存在下，DPBF 在 415nm波长处的吸收强度随时间和激光功率的变化而下降。鉴于这些发现，Crizotinib-IR808 @BSA NPs可能成为808 nm单波长激光协同PDT/PTT治疗的候选药物。
图3. 体外协同抗肿瘤作用 (A) CT26 细胞中Crizotinib-IR808@BSA 与 Mito-Tracker Green的共聚焦显微图像。(B) 使用或不使用激光照射的情况下，用Crizotinib-IR808@BSA处理CT26细胞24 h的存活率。CT26细胞在不同处理组中的(C) DCFH-DA染色荧光图像、(D)Calcein AM/PI 染色荧光图像和(E)膜联蛋白V-FITC/PI分析。
接着，分析了在细胞水平的性能。首先，应用流式细胞术和CLSM研究CT26细胞对Crizotinib-IR808@BSA NPs的摄取。结果发现，细胞摄取出现在前30 min内，2 h后趋于稳定。Crizotinib-IR808@BSA NPs 的红色信号与Mito-track探针的绿色信号呈现出共定位，表明它能够在线粒体积累。DCFH-DA是ROS检测器，在IR808和Crizotinib-IR808 @ BSA NPs+激光组中观察到绿色荧光，表明它们可被激光激活诱导ROS生成。使用Calcein AM/PI进行染色实验，以识别活体（绿色）和死亡（红色）的 CT26 细胞，发现激光照射产生的光疗与化疗协同作用，增加了Crizotinib- IR808@BSA NPs对癌细胞的毒性。
图4. 体内NIR-II荧光成像性能 (A)注射Crizotinib -IR808@BSA后不同时间点荷瘤小鼠的NIR-II荧光图像和(B)肿瘤的荧光强度。(C)Crizotinib-IR808@ BSA注射后24小时NIR-II成像下手术过程图像。(D)注射Crizotinib -IR808@BSA后主要器官及肿瘤荧光强度的离体荧光图像和(E)半定量分析。
为了探究体内肿瘤成像能力，将Crizotinib-IR808 @ BSA NPs注射到CT26荷瘤小鼠中，发现荧光亮度在24 h达到最大值，72 h后减弱。之后，在NIR-II成像指导下对CT26荷瘤小鼠进行了肿瘤切除，证明Crizotinib-IR808 @ BSA NPs能够正确指导肿瘤的完全切除。对切除的肿瘤和主要器官进行了离体NIR-II成像分析，发现Crizotinib-IR808 @ BSA NPs对肿瘤具有高选择性，此外还在肝脏和肾脏中聚集，并且两者的信号强度都随着时间降低，表明可能存在的排泄途径。
为了探究体内光疗抗肿瘤活性，通过红外温度计跟踪荷瘤小鼠的温度波动，发现Crizotinib-IR808 @ BSA NPs在体内能维持接近50℃的最高温度杀死肿瘤细胞，同时减轻在过高温度(> 60°C)对正常组织的伤害。进一步研究其协同光热治疗的抗癌效果，在接受激光照射后，给予Crizotinib-IR808@BSA NPs的小鼠中的肿瘤显著缩小且大部分消失，肿瘤的相对体积和重量均有显著降低。各组之间的体重轻微增加且无显著差异，这表明治疗通常耐受良好。染色实验显示与对照组(单独使用PBS、PBS +激光和Crizotinib-IR808@BSA NPs)相比，Crizotinib-IR808@BSA NPs +激光治疗组的肿瘤细胞坏死/凋亡面积更大。以上结果与体外实验结果一致，表明激光照射Crizotinib-IR808 @ BSA NPs可与化疗、PDT和PTT同时进行，以抑制肿瘤。
图6. 体内毒理学分析 (A)CT26荷瘤小鼠不同治疗后血液生物标志物的血液生化测定。(B)不同治疗组的主要器官代表性H&E染色图像。
为了探究Crizotinib-IR808@BSA NPs的毒性和药代动力学，对小鼠血液中的Crizotinib-IR808浓度进行实时半定量，得到其半衰期为24.23 min。血试验测量了红细胞(RBC)的溶血率，测定结果溶血率低于1%，表明Crizotinib-IR808 @ BSA NPs具有优异的血液相容性。通过血液生化分析进一步证实了使用Crizotinib-IR808 @ BSA NPs治疗对肝、肾或心脏功能参数无影响。此外，注射Crizotinib-IR808 @ BSA NPs的健康小鼠的主要器官的H&E染色照片也显示，未对小鼠产生显著毒性。根据这些发现，Crizotinib-IR808 @ BSA NPs具有较高的肿瘤靶向化疗光疗作用和较低的副作用发生率。
总结与展望：作者设计的Crizotinib-IR808 @ BSA NPs已成功用于体内NIR-II成像引导的化学光疗。Crizotinib-IR808是由临床应用药物Crizotinib和近红外荧光染料IR808共价结合而成。Crizotinib-IR808的独特结构赋予其c-Met靶向能力、优异的1O2生成效率和高光热转换效率，具有良好的体内治疗应用前景。通过BSA封装，Crizotinib-IR808的光学稳定性和水溶性得到改善，并且还显著改善了结直肠癌中的特异性积聚，从而更容易区分脉管系统、肿瘤和周围边界。除了提高小鼠寿命和完全消除肿瘤外，这种治疗方法在作者的研究中也显示出相对最小的不良作用。该生物相容性分子蛋白复合物治疗探针具有高时空分辨率NIR-II成像模式和高效治疗功能，有望用于肿瘤的精确检测和高效治疗。
参考文献
Hu, Z.; Li, R.; Cui, X.; Chen, Z., Albumin-Based Cyanine Crizotinib Conjugate Nanoparticles for NIR-II Imaging-Guided Synergistic Chemophototherapy. ACS Applied Materials & Interfaces 2023, 15 (28), 33890-33902.
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