本文要点：诊断较晚和早期淋巴结转移是卵巢癌的高致死率的主要原因，及时诊断卵巢癌并进行分期手术和治疗可使患者的5年生存率超过90%。卵巢位于盆腔深处，具有复杂的解剖结构和淋巴引流，降低了近红外一区荧光成像（NIR-I）的分辨率和灵敏度。目前已报道的卵巢癌NIR-II成像研究侧重于通过腹膜内异种移植模型检测晚期转移。然而，考虑到早期癌症检测可显著提高患者的生存率，因此定位早期原位卵巢肿瘤至关重要。
研究内容：在本研究中，作者通过对DSPE-PEG（FDA批准的纳米颗粒产品的成分之一）和苯并噻二唑（一种有机NIR-II染料）进行纳米沉淀，获得了具有明亮的近红外荧光的聚合物纳米颗粒（NIR-II NPs）。为了模拟不同的临床场景，开发了早期原位肿瘤模型和晚期癌症模型两种模型。通过NIR-II发射（约1060nm），NIR-II NPs首次实现了以高信噪比（13.4）对早期原位卵巢肿瘤的NIR-II荧光成像。NIR-II NPs在系统性给药后的约36小时内，在患有晚期癌症的小鼠中能够实时准确检测原位肿瘤、肿瘤区域淋巴结和微小（<1 mm）扩散性腹膜转移（S/N比值均大于5）。在NIR-II荧光成像引导下，作者在荷瘤小鼠中实现了准确的手术分期，并完成了与临床实践相当的肿瘤切除，这为转化NIR-II荧光成像引导手术提供了临床前数据。
图1. NIR-II NPs的性质和体外组织穿透分析（a）NIR-II NPs的合成示意图（b）使用DLS和TEM，NIR-II NPs表现出球形，平均粒径约80 nm（c）NIR-II NPs的紫外吸收光谱和荧光发射光谱（d）NIR-II NPs和ICG在连续激光照射下在水中的光稳定性（e）用猪肉组织覆盖后的NIR-II荧光成像（f）使用不同厚度的猪肉组织层的NIR-II NPs的信噪比。
NIR-II NPs在710 nm处有紫外吸收峰，在约1060 nm（在NIR-II区域中）处有荧光发射峰。NIR-II NPs的形状接近球形，尺寸约80 nm，其ζ-电位值为-32±0.26 mV，表明表面带负电，具有高稳定性和高组织渗透性。
图2. NIR-II NPs在卵巢癌细胞和皮下肿瘤中荧光成像。（a）与NIR-II NPs共培养后的癌细胞成像（b、c）注射NIR-II NPs后60小时内皮下肿瘤的荧光成像及荧光强度变化（d、e）探针注射60小时后，荷瘤小鼠淋巴结的体内成像及器官离体成像。
为了研究NIR-II NPs的生物成像能力，通过IGROV-1和NIR-II NPs共培养，结果显示NIR-II NPs可进入IGROV-1细胞。通过建立皮下肿瘤小鼠模型并注射探针，结果表明在注射后3小时可检测到荧光信号，约36小时后信号达到最大值。荷瘤小鼠淋巴结的体内成像表明，它们的颈部淋巴结、腋窝、骨盆和腹膜后淋巴结，显示出强烈的荧光。离体器官分布成像表明，NIR-II NPs主要聚集在肿瘤、淋巴结、肝脏和脾脏中。
图3. 原位微肿瘤和淋巴结NIR-II荧光成像。（a）早期原位卵巢癌模型和NIR-II荧光成像示意图（b、c）原位卵巢肿瘤和腹膜后淋巴结及荧光引导的原位肿瘤切除术后的手术区域的光学图像和相应的NIR-II荧光图像（d）手术前对荷瘤小鼠的表层淋巴结和盆腔淋巴结进行成像，然后进行荧光引导切除（e）淋巴结和生殖系统的离体NIR-II荧光成像（f）原位卵巢肿瘤和腹膜后淋巴结的组织病理切片。
NIR-II NPs能够检测到脂肪层包围的原位肿瘤，而不会检测到正常卵巢。并且准确地检测到微原位卵巢肿瘤（约2毫米大小），残留荧光可忽略不计，表明该探针在早期检测微小卵巢癌症方面具有很高的潜力。NIR-II NPs在原位卵巢肿瘤的信噪比（S/N）为13.4，在肿瘤区域淋巴结（盆腔和腹膜后淋巴结）的信噪比为9.1。此外，冷冻切片荧光成像证实了肿瘤和淋巴结中存在NIR-II NPs。
图4. 晚期卵巢癌模型中原位和转移肿瘤的NIR-II成像（a）晚期卵巢癌症模型和NIR-II荧光成像的示意图（b）光学图像和相应的NIR-II荧光图像（c）在NIR-II NPs荧光引导下切除肿瘤和病变淋巴结后的手术区域的光学图像和相应的NIR-II荧光图像，术后未检测到明显的荧光信号（d）解剖的肠和肠系膜的HE染色切片（e）原位瘤和胰腺和子宫上的转移瘤以及肿瘤区域淋巴结的HE染色切片。
为了研究NIR-II NPs在晚期卵巢癌小鼠模型中检测原位卵巢肿瘤和腹膜转移的能力，及其在术中荧光指导切除小尺寸（小于1cm）残余病变（R0）的能力。通过建立一个晚期卵巢癌模型，发现NIR-II NPs可以清晰的显示原位卵巢肿瘤、腹膜转移和区域淋巴结边缘，可以有效的进行NIR-II NPs引导的原位肿瘤和转移的完全切除，手术后没有总残留。此外，原位肿瘤、转移瘤和肿瘤区域淋巴结的信噪比分别为7.64、7.19和8.58。因此，NIR-II NPs可以在晚期卵巢癌症动物模型中准确识别不同部位的肿瘤，并定位手术期间需要探查和切除的肿瘤区域淋巴结。
图5. 毒性分析（a）与NIR-II NPs共孵育后的细胞活力分析（b、c）NIR-II NPs给药组和对照组小鼠在第1、7和28天的ALT和AST、BUN和CREA值（d）NIR-II NPs给药组和对照组小鼠主要器官的HE染色切片。
由于生物安全性是生物医学应用的先决条件，因此对NIR-II NPs的体外和体内毒性进行了分析。在200 μg/mL⁻¹的NIR-II NPs浓度下，细胞活力保持在80%以上，表明NIR-II NPs相对无细胞毒性。肝功能的指标（ALT、AST）以及肾功能的指标（BUN、CREA），均在生理范围内。此外，HE染色切片显示，给药组和对照组没有表现出显著的形态学差异。因此，NIR-II NPs在体外和体内肿瘤成像应用中是安全的。
总结与展望：在本研究中，作者合成了明亮的NIR-II NPs，并在原位肿瘤模型中实现了早期微卵巢癌的高信噪比（13.4）成像。这是关于NIR-II荧光成像在早期原位卵巢癌症中的首次报道。在早期原位肿瘤模型和晚期癌症模型中，NIR-II NPs均能准确识别原位肿瘤、肿瘤区域淋巴结和微小（<1mm）扩散性腹膜转移（S/N比值均大于5）。并且NIR-II NPs在手术中能够实时准确地检测到不同位置的微小卵巢肿瘤和肿瘤区域淋巴结。作者表示接下来的研究将侧重于优化NIR-II NPs的特性和靶向设计，并验证其在大动物卵巢癌模型中的成像能力，促进NIR-II荧光成像的临床转化。
参考文献
Pu, T.; Liu, Y.; Pei, Y.; Peng, J.; Wang, Z.; Du, M.; Liu, Q.; Zhong, F.; Zhang, M.; Li, F.; Xu, C.; Zhang, X., NIR-II Fluorescence Imaging for the Detection and Resection of Cancerous Foci and Lymph Nodes in Early-Stage Orthotopic and Advanced-Stage Metastatic Ovarian Cancer Models. ACS Appl Mater Interfaces 2023.
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