本文要点：作者构建了一种简单但有用的D-A型线粒体靶向近红外二区荧光团（MTF）。这种线粒体靶向染料MTF不仅表现光热效应，而且具有光动治疗效果。被DSPE-mPEG包裹成纳米粒后，实现高肿瘤特异性靶向，可以用于NIR-Ⅱ荧光引导的光动力学治疗（photodynamic therapy PDT）和光热力学治疗（photothermal therapy PTT）。
各种各样的NIR-Ⅱ染料几乎都是基于D-A-D型的对称荧光团或多次甲基荧光团。作者希望探索具有优异性能的独特小分子NIR-Ⅱ探针，成为癌症治疗临床应用的候选对象。光动力治疗和光热治疗是广泛应用于癌症治疗的新型疗法。PDT中，光敏剂（PS）在光照条件下产生氧自由基从而杀死肿瘤细胞。尽管PDT因其时空控制、无入侵性和良好的选择性而被视为治疗许多恶性肿瘤的有力工具，但是临床应用的卟啉、酞菁及其类似物等光敏剂通常处于可见及紫外区，阻止其在深部肿瘤治疗中的应用。PTT中，高光热转换效率的材料把光转换成热量从而杀死肿瘤细胞。然而热休克蛋白HSP会在PTT过程中产生，降低治疗效果。因此开发一种新的NIR-Ⅱ探针，实现更深的穿透深度成像、更高分辨率并将PDT和PTT结合起来可获得更好的治疗效果。
MTF在没有任何配基修饰下实现了线粒体靶向能力，在NIR-Ⅱ（~1015nm）表现出优异的荧光发射能力。为进一步提高体内的适用性，使用DSPE-PEG2000通过纳米沉淀法封装MTF，得到MTF纳米点。研究了MTF和MTF纳米点的光学性能、光动力学、光热力学性能以及抗肿瘤能力。它们表现出较好的NIR-Ⅱ肿瘤靶向性和深层组织穿透性，能够实现实时NIR-Ⅱ荧光成像。
结论
图1
图1a表示MTF探针的合成路线，反应物1通过迈克尔加成得到2。经过硫代乙酸和三氟化硼醚处理，反应物2转化成为关键中间体硫代吡啶鎓3。再通过Knoevenagel缩合，与4形成MTF。Maldi-Tof等表征手段证明了MTF的成功制备。如图1b作者测量了DCM为溶剂的MTF光学性质。MTF具有中心714 nm的强近红外吸收，有三个发射峰：一个在近红外一区（420 nm激发），另外两个在近红外二区（808 nm激发）。如图1c，在DCM溶剂中，NIR-Ⅱ的两个发射带分别位于~918 nm、~1015 nm。这可能因为溶剂吸收以及扭曲的分子内电荷转移效应（TICT）。在不同厚度的鸡胸组织上进行MTF辅助NIR-Ⅱ荧光成像的穿深能力测试。NIR-Ⅱ荧光强度与鸡胸厚度成反比。当厚度达到8 mm时，仍然可见微弱的MTF NIR-Ⅱ荧光信号。表明设计的MTF可以用于NIR-Ⅱ成像引导的光治疗。
图2
作者随后研究了MTF暴露在808nm激光（1W·cm¯²）下的光动力学表现。首先用1,3-二苯基异苯并呋喃（DPBF）作为检测探针来评估活性氧ROS的产生。通过检测DPBF在415nm的吸光度下降来记录MTF的ROS产生能力。如图2b，在808nm光激发下，在MTF存在下，观察到DPBF吸光度明显下降，对照组（DPBF+激光）的DPBF吸光度降低可以忽略不计（图2a），这说明MTF优异的ROS产生能力，并使用ICG作为参考，功率密度1W·cm¯²的808nm激光激发下，在DMF中测量MTF的ROS产生效率为0.34。此外，使用2’,7’-二氯二氢荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）在小鼠癌症4T1细胞中测量体外ROS的产生。DCFH-DA可被胞浆酯酶脱乙酰化为非荧光化合物，随后被ROS氧化为2’,7’-二氯荧光素（DCF），从而发射绿色荧光信号。如图2d，用40 nM MTF、808 nm激光辐射（0.5W·cm¯²）处理细胞，清楚观察到细胞内ROS信号。此外，作者还得MTF的光热效应进行了体外评价。如图2e、f，当暴露于808nm激光照射下，80 mM和100 mM MTF表现出显著的升温，但是纯水没有，这说明其具有很好地光热活性。之后，对其进行多次加热冷却循环，观察到最高温度略有下降。之后，通过CCK-8测定法测定体外细胞毒性，MTF在没有激光照射下对4T1细胞不表现出明显细胞毒性，但是如图2c所示，在808 nm激光（0.5W·cm¯²）激发下，细胞活力随着浓度增大而降低。特别的是，用40 nM MTF在808 nm激发下处理细胞，大约78%的细胞被破坏。40 mM MTF对4T1细胞表现轻微的毒性，这可能因为MTF的正电荷。此外，用钙黄绿素AM/PI染色法测量活细胞，808 nm激光照射下，4T1细胞被染成明显的红色荧光，但是另外两组“PBS+激光”、“MTF”表现出明显的绿色荧光。这些结果说明了MTF对癌细胞优异的PDT、PTT活性。图2g通过MitoTracker Red在4T1细胞的共定位实验证明了MTF的线粒体靶向能力。
图3
作者随后研究了体内MTF的表现。如图3a，作者构建了MTF与DSPE-PEG2000的纳米点，从而提高生物相容性和可行性。如图3b，TEM下观察到MTF点呈现均匀的球形，平均尺寸72±18nm；通过动态光散射（DLS）确定流体动力学直径为89±14nm。MTF点的zeta势确定为0.8mV，说明胶束表面具有正表面电荷。如图3c，在去离子水测量MTF的光谱性质，吸收峰位于~785 nm，在NIR-II有两个发射峰，一个在~920 nm，一个~1040 nm（808 nm激发），与MTF相似。所以纳米封装不影响MTF的光物理性质。在808 nm激发下，使用IR-26（QY=0.5%）作为参比，水溶液中测量MTF点的NIR-Ⅱ量子产率为0.512%。之后研究了MTF点的光热、光动力学性能：808 nm照射下，含有MTF点的DPBF在415 nm处的吸光度显著降低，并且使用ICG作为参比，计算出水溶液中ROS产生速率约为0.026.此外在含有10% PBS的水溶液中和DMEM介质中，MTF点的平均尺寸在15天内保持不变，说明MTF点的高稳定性。在808 nm激光照射下，与ICG相比，MTF点在水中表现出优异的光稳定性。此外，MTF点表现出与MTF相同的光热活性。计算出来的光热转化效率为~0.39。用体外线粒体共定位实验说明了MTF点具有良好的线粒体靶向能力，这表明MTF点可以用于体内NIR-Ⅱ成像引导PDT、PTT。
图4
如图4a，在皮下4T1荷瘤Balb/c小鼠评估体内MTF点的NIR-Ⅱ荧光成像。静脉注射200 mg后的6、12、24、36、48小时，在肿瘤部位观察到明显的荧光信号。信号从注射后12 h开始逐渐增加。肿瘤荧光强度在24-60 h内与其他组织显著不同，在48 h达到最大值。之后解剖小鼠观察脏器分布。肝脏和脾脏表现出最强的NIR-Ⅱ信号，其次是肿瘤，表明了肝胆清除途径。如图4b、c，注射MTF点48 h后将肿瘤暴露在808 nm激光下连续6 min，温度在6 min内升高至接近55 ℃，说明了高效的光热活性。如图4d、e，测量4T1肿瘤小鼠在是否注射MTF的体重和肿瘤体积。如图4f、g，治疗22天后，与其他三组相比， “MTF点+激光”组的肿瘤受到显著抑制。体外肿瘤组织的H&E染色显示，808 nm+MTF点处理时，肿瘤细胞明显被破坏。所有组H&E染色的主要器官都没有观察到炎症病变。此外，主要血细胞也在正常范围内。所有结果说明，MTF点可以作为一种有效的PDT、PTT抗肿瘤药物，没有明显的副作用。
总结
作者构建的新型NIR-Ⅱ有机分子MTF具有如下几个优势：在NIR-Ⅰ和NIR-Ⅱ有强的荧光；可以在没有靶向配基下进行线粒体成像，并且具有显著的PDT、PTT疗效；MTF与DSPE-PEG2000形成纳米点从而诊断和治疗4T1肿瘤。
参考文献
Ding, Qihang, Ling Mei, Yu Liu, Shan Zhou, Lu Chen, Yuying Liang, Mingle Li, Hui Zhou, Y. I. N. Chao, and Jong Seung Kim. "Mitochondria-targeted Fluorophores for in vivo NIR-II Imaging-guided PDT/PTT."Chemical Communications (2023).
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