本文要点：七甲基菁染料可在近红外(NIR)窗口进行深层组织荧光成像。基准染料ZW800-1的小分子偶联物已经在人体上进行了测试。然而，由于结构中化学不稳定的C4’-O-芳基连接物容易被生物亲核试剂切割，ZW800-1偶联物的长期成像方案的开发受到限制。本文报告了一种模块化的合成方法，合成了新型的双束缚两性离子七甲基菁染料，染料为ZW800-1的结构类似物，但稳定性大大提高。这种双束缚染料的NIR-I和NIR-II版本可以与蛋白质结合，如单克隆抗体，而不会导致荧光团降解或染料堆积在蛋白质表面。该荧光抗体结合物在异种小鼠肿瘤模型中显示出良好的肿瘤靶向性。双束缚分子设计提供的增强的稳定性将使新的活体近红外荧光成像实验成为可能，并可能移植到人类身上。
在NIR-I(700-1000 nm)或NIR-II(10001700 nm)窗口中具有吸收和发射波长的荧光团的在生物医学成像方面具有很大的应用潜力，因为近红外光对皮肤和组织有相对较深的穿透能力。几十年来，吸收/发射波长约为800 nm的临床近红外七甲川菁染料吲哚青绿(ICG)一直被用于光学成像和诊断(方案1)。虽然ICG被广泛应用，但它的最终潜力是有限的，因为其不能与靶向生物分子结合。一种商用NIR-I染料IRdye800CW，分子中含有羧基和多个磺酸盐，使其可以生物偶联且具有良好的水溶性。许多生物偶联物已经被制备并用于体内成像性能的评估。在某些情况下，非目标器官组织中不希望的染料或荧光生物结合物积累被观察到，这促进了两性离子染料的发展，因为其可以减少染料与生物表面的结合。一个典型的例子是ZW800-1，它已经用于不同类型的生物偶联十多年。其染料本身或小分子结合物是非常亲水的，通过肾脏从血液中迅速清除。ZW800-1与靶向癌症组织的环-RGD肽基序的偶联物，已进入临床试验。也有越来越多的报告使用ZW800-1或结构类似物标记用于活体成像和组织学应用的大分子，或生物材料，如细胞表面、水凝胶、纳米颗粒、3D打印生物复合材料或用于组织工程应用的细胞外基质生物聚合物。对于这些大多数的应用来说，一个必要的染料性能特性是荧光生物偶联物的长期化学稳定性，这一要求突出了ZW800-1潜在的化学反应问题；即，由于生物亲核试剂对染料的4‘-苯氧基进行亲核取代而导致的连接基团断裂(如方案1中的粉色箭头所示)。将ZW800-1标记的抗体或纳米颗粒样品在血清中孵育24小时的研究已经观察到荧光信号的大量损失。在近生理条件下，各种生物亲核试剂对染料的分子内和分子间攻击的可能性很大。由于染料降解造成的荧光信号的损失为纵向实验带来了不确定性（纵向实验旨在测量已标记有染料的植入生物材料的长期降解或运输）。
如方案1的顶部所示，本文开发了一种NIR-I菁染料的合成方法，这类染料由两个或四个侧翼线性臂立体地屏蔽在平面染料的每个表面上。方案1显示了本文的重点：即一类性能大大增强的新型双束缚和可偶联的NIR-I和NIR-II七甲基菁染料。有关双束缚染料的文献包括几个有机可溶的例子和一个水溶性分子。但这些染料大多数都不在近红外区域发射，也没有一种是为水中的生物偶联而设计的。本文通过制造稳定的双束缚的ZW800-1解决了其的降解问题，称之为dsZW800-1。此外，通用的合成方法提供了双束缚的NIR-II荧光染料dsZW1015，其吸收/发射最大值>1000 nm，生成了dsZW1015标记的抗体结合物，并成功地用于对小鼠肿瘤进行体内NIR-II荧光成像。
方案1
实验结果：
1.dsZW800-1的合成
dsZW800-1的合成如方案2所示。合成的关键中间体是未束缚染料3，它是在温和的条件下用苯酚2取代前体1中的4‘-氯原子组装而成的，其中2的结构上带有两个含有末端叠氮基的附加臂。随后通过皂化反应将3转化为无束缚染料4，然后在铜的催化下发生叠氮-炔环加成反应共价连接两条侧翼带，以62%的产率合成了dsZW800-1。
方案2
2.dsZW800-1的分子结构
用标准波谱方法对所有化合物的分子结构进行了表征。ZW800-1和未束缚染料4的化学位移非常匹配，表明二者分子构象相似。相比之下，dsZW800-1的光谱包括多次甲基质子的特定高场化学位移，指示两条侧翼带中的三唑环的空间磁屏蔽。dsZW800-1的X射线晶体结构也证实了这种分子内屏蔽效应(图1)。通过与文献报道的具有4‘-苯氧基取代基的七甲基菁的晶体结构的比较，揭示了dsZW800-1中两条侧链引起的两个独特的结构特征。一个特征是4‘-苯氧基环相对于七甲基菁荧光团的取向。通常情况下，4‘-苯氧基环的纵轴远离七甲基菁的垂直面，但在dsZW8001中，4’-苯氧基环被侧翼带强迫与垂直的七甲基菁环对齐，并将其面朝染料的一端旋转。另一个独特的结构特征是分子内晶格堆积距离。通常情况下，七甲川菁染料表现出聚次甲基荧光团的滑动同面堆积，典型的分子间距离约为3.5-5.0 Å。但dsZW800-1的侧翼条带增加了每个分子的空间隔离，相邻荧光染料之间的分子间固态距离为~9 Å。因此，即使dsZW800-1的多个拷贝在自聚集条件下被迫聚集在一起，侧翼条带也确保了足够的空间分离，以防止染料转移偶极的强烈耦合。
图1
3.dsZW800-1的光谱性质和稳定性
表1中染料光物理性质的比较表明，与ZW8001相比，dsZW800-1中的两条侧翼带并没有显著改变最大吸收和发射波长或荧光峰宽度。有趣的是，dsZW800-1在PBS中的荧光量子产率(11.0%)明显高于形式上为结构异构体的未束缚荧光团4的荧光量子产率(8.1%)。这一差异表明，dsZW800-1中的约束侧翼带更有效地抑制了从染料激发态到周围水化壳层的非辐射能量转移，这通常是高共轭近红外染料在水中的主要能量弛豫途径。
接着进行光漂白实验量化ZW800-1、4和dsZW800-1的光稳定性，即使用带有620 nm长通滤光片的氙灯照射PBS中的不同染料溶液，并将漂白曲线拟合为单相指数衰减(图2)。光稳定性的测定顺序为4>dsZW800-1>ZW800-1。七甲基菁染料的主要光漂白途径是光生单线态氧与多次甲基荧光团的双分子反应，其次是键的断裂和非荧光羰基片段的形成。ZW800-1的相对较差的光稳定性与亲电单重态氧和具有给电子体4‘苯氧基取代基的七甲基菁化合物的高反应性一致。4和dsZW800-1的相对增强的光稳定性归因于近端线性臂或带提供的空间位阻屏蔽效应，这可能降低氧的光敏化效率和/或抑制随后与单重态氧的双分子反应。
表1
图2
继续评价每种染料的化学稳定性，将染料与1 mM谷胱甘肽(GSH)混合的溶液在pH 7.4的PBS缓冲液中孵育后，进行一系列光谱实验。GSH中的亲核性的硫醇取代七甲基菁的对苯氧基很容易跟踪，因为该反应在七甲基菁的吸光度中产生了明显的红移。图3a显示的是GSH与ZW800-1反应的化学产物。图3b中的曲线图比较了这三种染料在含有1 mM GSH的pH 7.4的PBS缓冲液中的稳定性。未束缚的染料ZW800-1和4的半衰期(t1/2)分别为7.1分钟和27分钟。相比之下，dsZW800-1与1 mM GSH孵育10小时后，吸收光谱没有变化，表明没有发生化学反应(由质谱仪证实)。由于某些细胞内的谷胱甘肽水平可以达到10 mM，将dsZW800-1样品与10 mM GSH孵育10小时，仍然没有证据表明dsZW800-1有任何降解。这种对GSH攻击的保护有效地证明了dsZW800-1中的两条侧翼带可以有效地完全阻止生物亲核试剂取代不稳定的七甲基菁4‘苯氧基。
图3
4. 利用dsZW800-1进行抗体标记
谷胱甘肽引起的染料降解实验表明，未捆绑的ZW800-1和4应当不是蛋白质标记的良好选择，因为随着时间的推移，不稳定的七甲川菁4‘苯氧基会被蛋白质表面的亲核侧链切割，例如蛋白表面赖氨酸残基的ε-氨基。评估ZW8001和dsZW800-1用于蛋白质结合的适宜性的实验也证实了这一推断。使用标准的酰胺键形成的化学方法将ZW800-1或dsZW800-1连接到山羊IgG抗体或牛血清白蛋白(BSA)上。结果显示，与dsZW800-1结合的蛋白质比与ZW800-1结合的蛋白质产生更高的标记度(DOL)，并且dsZW800-1标记的蛋白质的荧光强度高3-4倍。着眼于免疫球蛋白偶联物的稳定性，观察到IgG-dsZW800-1的NIR信号比IgG-ZW800-1稳定得多。已知的IgG-ZW800-1的化学降解是一个重大的技术限制，而IgG-dsZW800-1的稳定性大大增强。dsZW800-1有望作为一种稳定的近红外荧光标签，用来进行测量染料标记细胞或生物材料的降解或运输的纵向实验。
5. 使用dsZW800-1进行活体成像
通过将dsZW800-1结合到Panitumab(Pan,一种针对EGFR阳性肿瘤的临床单抗)上，评估dsZW800-1标记抗体的体内成像性能。图4a中Pan-dsZW800-1(DOL=3.1)的吸收光谱在772 nm处有一个相对较窄的峰，其激发产生的荧光光谱与游离染料相同。没有显示出与dsZW800-1染料在抗体表面的H堆积所对应的吸收峰蓝移，而染料的H堆积猝灭会染料的荧光，并可能改变抗体的生物分布。此外，Pan-dsZW800-1在4oC环境下15天的吸收光谱没有变化，这表明它与临床上使用的重组Pan具有非常相似的储存寿命。通过静脉注射Pan-dsZW800-1在EGFR+JIMT-1(三阴性乳腺癌)荷瘤小鼠身上测试体内成像性能。使用商业活体成像站(IVIS)和NIR-I荧光成像设置观察到特异性和高摄取率，平均肿瘤与背景比(TBR)在注射后72小时约为8，肝脏信号可以忽略(图4b，4c)。注射后72小时处死小鼠，器官的NIR-I荧光成像证实了Pan-dsZW800-1具有很高的肿瘤特异性(图4d、4e)。
图4
6. dsZW1015的合成
继续将双束缚七甲基菁改造为光谱范围扩大到在NIR-II区(1000-1700 nm)吸收和发射的荧光染料，以改善活体成像。最近商用InGaAs相机的出现极大地促进了NIR-II成像的研究，但目前限制进一步发展的一个因素是缺乏相对较小(MW<2000 Da)的亲水性和两性离子NIR-II染料，这些染料可以附着在靶向生物分子上，如抗体或粘附体，而不形成非荧光染料的H-堆积或改变靶向生物大分子的特异性。NIR-II染料广泛的疏水表面积使得生产用于靶向生物成像的水溶性生物结合物非常具有挑战性。一种著名的NIR-II花青染料FD-1080(方案1)，其结构包括疏水的苯并[c，d]吲哚杂环作为末端单元。在PBS溶液中，FD-1080(及其结构类似物)形成非荧光H-聚集体，因此必须将其配置成与血清蛋白的非共价络合物，或者包装在自组装胶束或脂质体中用于体内成像研究。FD-1080的第二个功能缺陷是缺乏合适的蛋白质结合位点。为了解决这两个问题，采用了方案3中所示的模块化合成序列来制备双束缚带、带电平衡的NIR-II染料dsZW1015。关键的合成前体是七甲基菁5，它是以商品化试剂苯并[c，d]吲哚-2(1H)-酮为起始的四步法制备的。随后的两个步骤引入了可共轭的羧基，并产生了未束缚的七甲川菁7，它被转化为所需的双束缚形式dsZW1015。值得注意的是，方案3中列出的所有化合物的非平面结构极大地促进了柱层析的纯化。
方案3
7. dsZW1015的光谱性质
NIR-II染料本身具有较低的荧光量子产率，dsZW1015在DMSO中的测量值为0.10%，未束缚的异构体7的荧光量子产率为0.11%，与文献报道的非极性有机溶剂中的NIR-II染料相当。在水中，NIR-II荧光量子产率更低，但dsZW1015-1在PBS中的荧光量子产率(0.014%)是7的荧光量子产率(0.006%)的两倍多。亮度的增加可能有两个原因。一个是NIR-II荧光团对周围水合球体的空间屏蔽增强(类似于上面的ZW800-1和4的比较)，第二个是染料自聚集方面的显著差异。吸收光谱表明，在PBS中，未束缚的7在~850 nm处显示出第二个蓝移的非荧光的H聚集吸收带，而双束缚的dsZW1015仅在980 nm处以发射单体的形式存在。
8.使用dsZW1015进行活体成像
以dsZW1015的NHS酯为原料，制备DOL=1.2的Pan-dsZW1015结合物。Pan-dsZW1015的吸收光谱只在1000 nm处显示一个发光单体染料峰(图5a)，没有证据表明多个染料的H堆积，在4 oC下15天后光谱性质也没有变化。dsZW1015应该目前是第一个与生物大分子偶联的两性离子七甲川菁NIR-II染料。在JIMT-1小鼠肿瘤模型上评估pan-dsZW1015的成像性能。活体全身NIR-II荧光图像显示，由于附加的疏水性苯并[c，d]吲哚类染料的影响，初始肝脏信号很强(4小时和24小时)。尽管如此，在注射后72小时观察到明显的肿瘤靶向，并且偏离目标的信号非常低(图5b和5c)。成像结果表明，dsZW1015是具有空间屏蔽和平衡电荷的良好结构组合，能够产生具有特定靶向特性的标记抗体，用于活体对象的有效近红外成像。
图5
结论：
综上所述，本文验证了双束缚七甲川菁染料是一类新的高性能、可偶联的近红外荧光团。与基准NIR-I染料ZW8001相比，双束缚类似物染料dsZW800-1显示出略高的荧光亮度，更好的化学稳定性和两倍的光稳定性。在使用染料标记抗体的荧光成像方面，dsZW800-1优于ZW800-1，并且将更适合于测量植入染料标记生物材料的长期降解或运输的纵向实验。值得注意的是，使用与ZW800-1密切相关的结构的NIR-I七甲川菁染料的荧光探针越来越多，由于存在活性4‘-苯氧基，每个荧光探针都可能有稳定性限制。在这种情况下，都应该直接制备这些NIR-I染料的双束缚形式，以期改善稳定性和成像性能。模块化合成方法的一个优点是末端杂环可以直接变化，如制备末端带有苯并[c，d]吲哚杂环的双束缚七甲基菁染料dsZW1015，该末端苯并[c，d]吲哚杂环将吸收/发射波长扩展到NIR-II区域。空间屏蔽和平衡电荷的结构组合抵消了dsZW1015中荧光团带来的疏水性增强，可以生成染料标记的抗体，用于活体小鼠肿瘤的有效NIR-II荧光成像。未来的设计迭代可以在末端杂环中加入合适的官能团，以生产这些双束缚花青染料的生物响应型版本，用于下一代“turn-on”或“ratiometric”近红外荧光探针的应用拓展。
参考文献
Li, D. H.; Gamage, R. S.; Oliver, A. G.; Patel, N. L.; Muhammad Usama, S.; Kalen, J. D.; Schnermann, M. J.; Smith, B. D., Doubly Strapped Zwitterionic NIR-I and NIR-II Heptamethine Cyanine Dyes for Bioconjugation and Fluorescence Imaging. Angew Chem Int Ed Engl 2023, e202305062.
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