本文要点：阿尔茨海默病(AD)是临床最广泛的神经退行性疾病，严重威胁人们的生命健康。β 淀粉样蛋白 (Aβ) 作为AD的典型病理生理学标志物，来源于单体 Aβ 自发聚集成形成不溶性Aβ原纤维，积聚并沉积在大脑中，从而诱发神经系统性疾病。目前还没有有效的策略来治疗AD的发生发展。脑脊液的诊断过程具有侵入性（脊髓穿刺），因此不被广泛接受。相比之下，开发用于检测Aβ蛋白的成像探针为AD的早期表征和及时干预提供了有效策略，如正电子发射断层扫描（PET）、单光子发射计算机断层扫描（SPECT）和磁共振成像（MRI）等。然而这些探针具有灵敏度低、成本高、电离辐射和高背景等缺点，因此开发可激活荧光探针具有重要意义。

目前，用于Aβ蛋白的成像荧光探针有硫黄素T（ThT）和硫黄素S（ThS），但他们的发射波长短（480 nm），血脑屏障（BBB）穿透能力差，限制了它们的体内应用。此外，虽然有一些可激活的荧光探针用于Aβ蛋白的体内成像，但这些探针的荧光发射通常位于NIR-I区(650–900 nm) ，穿透深度浅，信噪比(SNR)低，不适合脑组织成像。因此本文作者开发了NIR-II区（900–1700 nm）发射的可激活荧光探针用于Aβ蛋白的体内成像(图1)。

图1. DMP2用于Aβ蛋白的体内成像

首先，作者设计并筛选了一系列Aβ蛋白的特异性NIR-II荧光响应探针(D-π-A结构)，探针由三部分组成：咔唑或二甲氨基苯为电子供体（D），噻吩桥或双键为π桥，同时提高亲脂性（容易透过BBB），以及苯并吲哚鎓作为电子受体（A），合成了荧光探针ECV、DMP1、DMP2和DMP3（图2a）。随后，作者评价了探针的光学性能。溶剂效应测试说明ECV发射位于NIR-I区，其他三种化合物均处于NIR-II区（图2e-h）。Gaussian09W计算进一步说明更强的给电子作用能够增强推拉效应，从而产生NIR-II区的红移荧光（图2i）。

图2. (a) 探针的分子结构 (e、f、g、h) ECV、DMP1、DMP2和DMP3探针在不同极性溶剂中的荧光光谱。(i) 探针在水中的HOMO-LUMO能极差。

此外，作者还观察到这四种探针对粘度有依赖性的荧光变化，所以推断探针可能发生了扭曲的分子内电荷转移过程(Twisted Intramolecular Charge Transfer, TICT)。TICT效应已被用于检测A β蛋白的荧光探针的构建，抑制分子内的TICT效应能够提高荧光探针的稳定性和量子产率。紧接着，作者测试并筛选了探针对Aβ原纤维的响应情况。与Aβ原纤维孵育后，DMP1、DMP2和DMP3的NIR-II荧光分别选择性的增强了27.0倍、41.8倍和43.1倍，而ECV几乎无差异（图3f-h）。荧光增强可能是由于Aβ原纤维介导了探针在光照射情况下从非发射扭曲的TICT状态转变为高荧光准平面局部激发(LE)状态。相比于商业探针ThT仅5.1倍的荧光增强，DMP2和DMP3具有更理想的成像对比度。基于荧光的饱和结合法计算DMP2的结合亲和力(Kd)为42.0 nM，与Aβ原纤维具有最佳的结合亲和力（图3i-k）。然后作者使用DMP2测试其与ThT结合的Aβ原纤维的竞争位移能力，置换率高达72%(图3l)。

图3. (e) 探针与Aβ聚集体结合后的荧光增强倍数 (f、j、h) 探针在其他潜在干扰物存在时对Aβ聚集体的选择性研究(1-10：潜在干扰物，离子、氨基酸和牛血清白蛋白等11：Aβ 单体) (i、j、k) PBS溶液中探针的结合亲和力测定 (l) DMP2和ThT探针的竞争置换实验。

然后，作者使用分子对接软件模拟了探针与Aβ原纤维之间的相互作用(图4)，进一步说明了DMP2探针具有高选择性的荧光“off-on”响应和与Aβ蛋白的强结合亲和力，在检测Aβ蛋白方面具有很大前景。

图4. DMP2与Aβ原纤维的相互作用图

随后，作者检测了DMP2与Aβ蛋白结合后NIR-II荧光的穿透深度。NIR-II荧光在0.5 cm厚度下的信噪比仍然为20.4，在1.5 cm的厚度上，NIR-II荧光信号仍是可识别的(图5a-b)。与此同时，作者通过构建体外血脑屏障模型（图5c）测试了DMP2穿透血脑屏障的能力。DMP2的通透性随孵育时间的增加而增加，120 min后达到23.8%，比ThT高9.9倍，与FDA批准的可穿透血脑屏障的药物替莫唑胺(TMZ)相当，说明其其亲脂性适合穿透血脑屏障(图5d)。

图5. (a、b) DMP2探针在溶液和脑切片中的组织渗透能力研究 (c、d) 体外血脑屏障模型及Transwell室渗透性试验

在活体测试中作者选用探针DMP2与商业探针ThS分别对野生型小鼠和转基因AD模型小鼠的脑组织切片进行成像对比，正如预期的，在DMP2或ThS染色后，在野生型小鼠脑切片中没有观察到明显的荧光。相比之下，在用ThS和DMP2染色后，来自AD模型小鼠的脑切片在大脑皮层和海马区域显示出聚集性荧光，表明DMP2对Aβ蛋白的检测具有高度特异性。此外，对脑切片中线性靶向区域荧光强度的定量研究进一步说明了DMP2和ThS均可染色Aβ蛋白，但前者的信号更强（图5 e-f）。

图5 (e、f)野生型小鼠和转基因AD模型小鼠的脑组织切片成像

最后在体内成像时，作者选用8月龄的APP/PS1转基因AD模型小鼠和野生型小鼠进行研究（图6a）。野生型小鼠在注射DMP2后各个时间点的脑内荧光信号均较弱。而AD模型小鼠仅注射后10分钟就观察到了明显的NIR-II荧光信号，且能在脑内长时间保留，可用于体内实时纵向成像（图6b）。随后作者处死小鼠提取脑组织，记录NIR-II荧光成像，进一步证实NIR-II荧光来源于AD小鼠脑组织。同时，共聚焦成像显示的皮层和海马部位明显的荧光信号说明DMP2可以高效高特异性的识别AD模型小鼠的Aβ蛋白，可用于Aβ蛋白的无创成像，深入了解疾病的发生发展（图6f）。

图6 (a) DMP2探针的NIR-II荧光成像示意图 (b)野生型小鼠和AD模型小鼠的活体脑成像 (f) Aβ单克隆抗体(MOAB)染色后的脑组织切片离体荧光图像

参考文献

Miao, J., Miao, M., Jiang, Y., Zhao, M., Li, Q., Zhang, Y., et al. (2023). An Activatable NIR-II Fluorescent Reporter for In Vivo Imaging of Amyloid-beta Plaques. Angew Chem Int Ed Engl, 62(7), e202216351.

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