本文要点：基于稀土掺杂纳米晶体(RENC)的短波红外(SWIR，1000-3000 nm)荧光生物成像具有更深的穿透深度和更高的清晰度，然而，它们的降频发射很少能在超过1600 nm外显示足够的亮度，特别是在NIR-IIc中。本文提出了一类铥(Tm)自敏化RENC荧光探针，它在1600-2100 nm(NIR-IIb/c)处显示出明亮的降频发光，可用于活体生物成像。惰性外壳涂层最大限度地减少了表面猝灭，并结合了强交叉弛豫，允许LiTmF₄@LiYF₄纳米粒子通过吸收800 nm(大斯托克斯位移~1000 nm，绝对量子产率~14.16%)或1208 nm(NIR-II_in和NIR-II_out)的近红外光子来发射强降频发射。此外，掺杂Er³⁺进行能量俘获，实现了四波长的近红外辐射和明亮的NIR-IIb/c发射。我们的结果表明，基于Tm³⁺的NIR-IIb/c纳米探针具有高信噪比和清晰度，为未来应用和转化到不同领域提供了新机会。

短波红外(SWIR，1000-3000 nm)，也被定义为第二近红外区(NIR-II)，在生理研究和生物医学应用中具有广阔的应用前景。在这一区域，超过1500 nm的发射被认为是另一个具有更高空间分辨率和更深成像深度的成像窗口。值得注意的是，NIR-IIb(1600-1700 nm)、NIR-IIc(1700-2000 nm)和NIR-IId/NIR-III(2100-2300 nm)波段的长端显示出低散射损失和接近于零的自发荧光，这进一步提高了空间分辨率、信号背景比(SBR)和成像穿透深度，以实现更好的生物成像清晰度。然而，迄今为止，发射超过1600 nm的NIR-IIb荧光/发光探针仍然非常有限，仅有报道尾部延伸至1600 nm的AIEgens和硫化铅(PbS)/硫化镉(CdS)量子点。这些关键波长区域需要更多的具有高效率、低细胞毒性、大斯托克斯位移和光稳定性的清晰且更亮的探针。

稀土掺杂纳米晶体(RENC)由于其近红外激发带、窄发射带和上述其他所需的优点，已成为理想的NIR-II成像纳米探针，在多路传感、时间门控检测、成像引导治疗和外科手术中具有巨大的潜力。据报道，有几个离子在NIR-II区有发射，包括在1185 nm处的Ho³⁺，1060 nm，1310 nm处的Nd³⁺，1525 nm处的Er³⁺，以及1450 nm处的Tm³⁺(图1a)。Tm³⁺是少数几种表现出从紫外到中红外区域的不同光谱转换的RE³⁺离子之一。通常报道的Tm³⁺在近红外-II区的斯托克斯或下移发光(DSL)位于1450 nm(³H₄→³F₄，弱跃迁)，显示出低发光效率，并在该区域与水强吸收竞争(图1a)。因此，这极大地限制了基于Tm的探针在NIR-II区域进行光学成像。然而Tm³⁺的³F₄→³F₆跃迁显示出从1600到2100 nm的强烈发射波段，通过进一步将穿透深度增加到亚厘米水平并消除自发荧光，可以实现高对比度的深层组织成像(图1a)。到目前为止，Tm³⁺(1600-2100 nm)的这种光谱特性主要用作块状激光玻璃的激光应用的增益材料，还没有利用Tm³⁺的NIR-IIb/c区发射用于活体生物成像的报道。这可能是由于在制备明亮的Tm掺杂纳米颗粒过程中存在严重的浓度猝灭和表面猝灭，以及不适当的敏化剂所致。

在这里，为了满足NIR-IIb或NIR-IIc发射探针的要求，本文首次提出了用于活体生物成像的高掺杂Tm³⁺离子自敏化纳米颗粒。在本研究的设计中，Tm³⁺离子同时作为敏化剂和激活剂来吸收800 nm(近红外-I)或1208 nm(近红外-II)的光子，由于这种辐射跃迁引起的强烈的交叉弛豫(CR)，它们产生了有效的1600-2100 nm斯托克斯发射(³F₄→³H₆)。此外，还合理地掺杂了能量陷阱离子，如Er³⁺和Dy³⁺，以介导Tm³⁺敏化的下移发射。这些明亮的Tm纳米粒子使得非侵入性深层组织成像能够在SWIR窗口中以更高的质量和清晰度研究生物相互作用。

研究内容：在生物成像应用之前，首先系统地研究和比较了惰性/未掺杂壳层对重度掺杂Tm³⁺纳米颗粒发光的影响。补充图1a和图1c中的透射电子显微镜图像表明，所得到的纯LiTmF₄核和Tm@Y核壳纳米粒子(Tm-NPs)具有均匀的形貌，平均尺寸分别为~9.8 nm×13.7 nm和~19.3 nm×24.8 nm(宽度×高度)。粉末X射线衍射分析表明，它们的表面形貌为四方的(I4₁/a)空间群。Tm-NPs的衍射峰与四方LiYF4晶体的参考图很好地对应，表明形成了纯相纳米晶体(图1d)。Tm-NPs的HAADF STEM图像和元素映射结果进一步证实了它们的核-壳结构，成分边界清晰，产生了明亮的Tm³⁺核和深色的Y³⁺壳(图1e)。

接着研究单一Tm掺杂的胶体纳米晶体的发光性质。Tm-NPs在环己烷溶液中的下转移发光（DSL）为1600~2100 nm，这归因于³F₄→³H₆在800 nm光照射下的跃迁。由于Stark分裂的衬底具有³F₄态，~1800 nm处的多波段发射光谱位于NIR-IIb/c区，适合NIR-II成像。然而，与干燥的TM-NPs的全光谱(图1a)相比，作为溶剂的环己烷由于其自身的强NIR-IIc吸收而严重猝灭了1680-1900 nm附近的发光。

图1

对于Tm³⁺的浓度介导的DSL，在纳米材料(仅核心)中也发生了严重的浓度猝灭，但在LiYF4壳的外延生长之后，观察到DSL强度的稳定增加(图2a)。电子填充过程可以解释Tm-NPs的强浓度依赖性发光现象，如图2c所示。Tm³⁺离子通过激发电子直接敏化吸收800 nm光子，并通过从³H₄到³F₄(1450 nm)，然后从³F₄到³H₆ (1600-2100 nm)的两个连续辐射跃迁路径填充³H₄态。³H₄与³F₄能级和³F₄到基态之间的能隙分别约为6850 cm⁻¹和5890 cm⁻¹。这两个紧密的能隙使得³H₄→³F₄和³H₆→³F₄跃迁之间能产生高效的Tm³⁺→Tm³⁺ CR，这保证了更多被吸收的光子填充到中间³F₄能级，然后跃迁到基态(³H₆) 以增加NIR-II发射强度。尽管³F₄→³H₆跃迁的发光单调增加，但随着Tm³⁺掺杂浓度从10%增加到40%，Tm-NPs的衰减时间逐渐减少，随着Tm³⁺掺杂浓度从60增加到100%，在1680 nm处的发射寿命可能由于尺寸差异而增加(图2b)。1450 nm发射寿命进一步证明了³H₄和³F₄能级种群竞争的浓度依赖性。随着Tm³⁺浓度的增加，发光强度进一步减弱，因为逐渐增加的CR抑制了³H₄态的自发发射，同时增加了³F₄的数量。LiYF4的壳层厚度从~ 1.7、2.8 nm增加到5.0 nm，正如预期的那样，在800 nm激发时，发射显著增加(图2d)，这表明外延惰性壳与耦合到表面的Tm³⁺激活剂分离。在1680 nm处发射的荧光寿命由0.2 ms和0.8 ms变化为5.2 ms，表明LiYF4壳体增厚降低了表面淬灭，在2.8 ~ 5.0 nm范围内寿命对壳体厚度特别敏感。鉴于此，推测这一现象可以从两个方面解释:(1)惰性壳抑制了浓度和表面淬灭，以及(2)Tm³⁺浓度的增加增强了CR过程。

值得注意的是，掺杂高浓度的Tm³⁺使Tm-NPs在NIR-II区域(1208 nm, ³H₅状态)激发，(800 nm处吸收截面为8.25 × 10−22 cm², 1208 nm处吸收截面为1.5 × 10−21 cm²)。这些Tm-NPs在1208 nm的照射下产生的发射峰和分支比与在800 nm激发下看到的相同。随着Tm³⁺离子浓度的增加或壳层厚度的变化，分别观察到DSL发射增强，且趋势相同(图2e)，说明这些发射波段来自相同的跃迁过程。这是第一次报道在可分散的NPs中观察到Tm³⁺在1600-2100 nm的发射，特别是在800 nm和1208 nm激发时。

接下来，选择了与Tm³⁺能级匹配的掺杂离子（如Er³⁺和Dy³⁺）用于能量捕获，旨在提供更明亮的NIR-II发射。首先在800 nm激发下研究了Er³⁺离子掺杂剂。其中，当掺杂Er³⁺时(<1%，0.2%为最佳，Tm(02Er)-NPs)，1680 nm处的下转移发射得到了提高，掺杂更多的Er³⁺导致了下降趋势(图2f)。此外，研究3F4状态下相应的时间分辨种群(图2g)。通过Tm³⁺和Er³⁺之间的能量转移，抑制Tm³⁺的CR，加速了³F₄状态的减少(图2 h)。当Er³⁺掺杂浓度进一步增加到10%以上时，虽然在1600-2100 nm处的发射强度有所降低，但在近红外区域，通过四波长照射，甚至可以激发得到Tm/Er“合金”NPs(如30%Er掺杂，Tm(30Er)-NPs)，并分别在980 nm和1530 nm激发时观察到附加发射带(图2i，吸收截面:800 nm时9.5 × 10−22 cm², 980 nm时1.075 × 10−21 cm², 1208 nm时1.75 × 10−21 cm², 1530 nm时2.12 × 10−21 cm²)。值得注意的是，由于⁴I_13/2水平的Er³⁺种群的增加，也发生了1525 nm辐射(⁴I_13/2→⁴I_15/2)，如在980 nm激发下。此外，在800 nm激发(4 W/cm²)下，Tm-NPs的发光量子产率(1600-2050 nm)为~14.16%，Tm(02Er) NPs的发光量子产率为~16.13%。这些“合金”NPs为成像、防伪等涉及多波长选择性激发调节的应用开辟了新的途径。然而，掺杂Dy³⁺并没有提高近红外发射，在Tm³⁺晶格中掺杂少量Dy³⁺(0.2%)会被强烈淬灭，因为Dy³⁺具有密集的阶梯状能级。

图2

基于Tm的NPs进行表面修饰，以提高其生物相容性

对于生物成像，选择优化的Tm(02Er)-NPs，并使用DSPE- PEG₂₀₀₀通过疏水-疏水相互作用进行修饰(图3a)。聚乙二醇化后得到Tm(02Er)-NPs@PEG, TEM图像如图3b所示，无明显聚集，动态光散射测定的水动力直径为112±0.7 nm(图3c)。监测长期胶体稳定性1个月。如图3d所示，在这段时间内没有发生明显的尺寸变化，也没有发生解离或沉淀，说明Tm探针在水溶液中分散良好且稳定。由于O−H振动的非辐射失活(图3e)， Tm探针在水溶液中的发光强度比在环己烷中下降得更多(9.4倍，在1680 nm处计算)。然而，1738 nm处的DSL强度与1680 nm发射处的DSL强度之比从0.37(环己烷)增加到0.76(水)，这是因为在该区域水的吸收比环己烷低(图1a)。

值得注意的是，Tm³⁺的DSL可以从NIR-IIb到NIR-IIc。以发射在NIR-IIb区域(1525 nm)的基于Er的NPs为参考，量化NIR-IIc发射的优势。在800 nm激发下，在NIR-IIb和NIR-IIc下，记录了相同浓度的基于Er-和Tm -NPs的相似发射强度(图3e)，随后使用HgCdTe (MCT)相机在不同的子窗口中成像(图3f)。两种探针分别在1524-1536 nm和>1700 nm范围内可以清晰区分。此外，尽管两者都可以在1500-1700nm的子窗口成像，但随着长通滤波器从1500、1600到1700nm的变化，Er-NPs@PEG逐渐变得无法检测到而明亮的基于Tm的探针仍然存在。这些结果表明，基于Tm的NPs可以作为NIR-IIb/c的优秀候选。此外，在相同强度下，填充这些纳米探针的毛细血管的发光图像显示，当SBR为1.35,FWHM = 0.55 mm的5 mm厚的1%脂内溶液覆盖时，仍然可以观察到基于Tm的NPs的发射，而Er-NPs@PEG的发射几乎无法检测到，这表明在NIR-IIb/c区域使用基于Tm的NPs具有相当大的穿透性和清晰度(图3g, h)。此外，24小时CCK8检测显示，即使浓度高达800µg/mL, Tm纳米探针的细胞毒性也很低(>90%存活率)。

图3

体内成像研究

为了评估使用基于Tm的探针成像的可行性，并在NIR-IIb/c中实现理想的清晰度和深层组织穿透，首次在800 nm激发下使用MCT相机检测超过1700 nm的发光来验证小鼠的全身血管成像和血液循环。强烈的NIR-IIc信号使注射后2分钟循环系统清晰可见。信号随注射后时间的增加而减小。随着时间推移，肝脏清晰可见(图4a)，表明Tm-探针主要通过肝胆系统代谢。此外，由同一血管测定的NIR-IIc信号强度在血液中表现出中等的半衰期(49 min)，可以勾画出病理状态下的血管血流动力学。与超过1500 nm成像(FWHM = 78µm)相比，通过高斯拟合测量FWHM，确定NIR-IIc区域血管宽度为64µm(图4b)，这表明NIR-IIc成像的空间分辨率提高了。这些结果证实了NIR-IIc区域的高分辨率成像性能。

此外，使用MCT和InGaAs (SD 640)摄像机进行血管成像，以确认基于Tm的探针在NIR-IIb区域的成像轮廓。结果表明，两者的组织SBR相似(~2.2)。而在相同条件下，除了InGaAs相机采用高增益模式外，MCT相机的背景噪声较低。这表明基于Tm的探针是优秀的NIR-IIb成像探针，它也可以在InGaAs相机上成像良好。同时，Tm探针在1500 - 1600 nm之间具有微弱的发射，因此使用1500 nm LP在NIR-IIb窗口的探测主要从1600 nm开始。此外，用Tm探针处理的小鼠的组织学评估显示，主要器官没有明显损伤。最后，采用Tm探针进行NIR-IIc成像，建立手术诱导的大脑中动脉闭塞(MCAO)模型，以可视化血液循环系统功能障碍。成像结果显示循环障碍，并且小鼠机体通过自我保护机制建立了侧支循环。

此外，为了证明在1700-2100 nm范围内检测NIR-IIc成像的优势，将Tm(02Er)-NPs@PEG和Er-NPs@PEG探针(相同浓度)的混合物静脉注射到小鼠体内，并用MCT相机在800 nm激发下成像。如图4d, e所示，NIR-IIc成像的SBR(1.56)高于NIR-IIb成像(SBR = 1.27)。并且，与NIR-IIb相比，NIR-IIc窗口可以更清晰地观察到微小的血管(包括Tm³⁺的部分发光)，这意味着比基于Er (NIR-IIb)的探针成像深度更深，清晰度更高。接着在口服灌胃小鼠两种发光强度相同的探针的混合物后，进行胃肠道成像。灌胃1.5 h后，评价NIR-II在不同子窗口的成像性能。与Er纳米探针的NIR-IIb成像(SBR = 5.4)相比，Tm基探针在NIR-IIc区域观察到更高的SBR(8.6)(图4f, g)。本文认为在1700-2100 nm子窗口的荧光/发光成像是一个重大突破，因为在1880 nm附近光吸收增加，光子散射最小化，组织自身荧光进一步被抑制。

继续使用Tm(30Er)-NPs@PEG探针进行了体外和体内成像，以提供多波长激发特性的概念证明。使用1%的脂内溶液验证Tm(30Er)NPs@PEG的NIR-IIc成像特性。在800 nm、980 nm和1208 nm激发下，可以观察到类似的穿透深度和SBR。其中，在800 nm激发下，侵彻深度最深。但是，在1530 nm激发时，由于水的强烈吸收，导致渗透深度最低(3 mm厚度以内)。进行胃肠道成像。在灌胃30 min后记录NIR-IIc的发光信号(1750-2250 nm)。SBR结果(图4h)显示，800,980和1208 nm激发提供了优秀的NIR-IIc成像。但是在1530 nm激发时，由于水在1500 nm附近有强烈的吸收峰，无法获得高质量的宽场成像。

最近有报道称，在1540 nm或1650 nm激发下，NIR-IIc共聚焦显微镜可实现穿透深度为~500 μm的腹股沟淋巴结成像，其穿透深度是1200-1400 nm范围内的两倍。但是，需要更高的功率密度的1540nm的光。这些结果表明，如果通过增加激发功率或提高探针亮度来克服由于吸水引起的干扰，那么将激发和发射扩展到NIR-II可以提高成像性能。由此可见，这种多波长激发和发射系统(图4i)为多通道成像/解耦治疗提供了最佳选择。

图4

结论：本文成功开发了一种高效的基于Tm³⁺的NIR-II发光纳米探针，其发射波长约为1800 nm，具有良好的生物相容性和良好的稳定性。纳米探针在800和1208 nm进行双波长激发，表现出NIR-IIb到NIR-IIc发射(1600-2100 nm,³F₄→³H₆)。这种前所未有的光学特性将为体内高对比度深层组织成像提供替代方案。值得注意的是，本文的研究结果表明，Tm探针辅助NIR-IIc成像在穿透深度和清晰度方面明显优于NIR-IIb子窗口，这可能是由于受限的散射背景。重要的是，在这项工作中，滤波片和成像探针的发射特性共同决定了实际的成像窗口。要详细地分析窗口的优势，未来的研究必须尽可能地保证特定窗口内的均匀发射和检测。预计本项工作将促进NIR-IIc区域所需的、具有更高量子产率的探针的研究和开发。

参考文献

Chang, Y.; Chen, H.; Xie, X.; Wan, Y.; Li, Q.; Wu, F.; Yang, R.; Wang, W.; Kong, X., Bright Tm(3+)-based downshifting luminescence nanoprobe operating around 1800 nm for NIR-IIb and c bioimaging. Nat Commun 2023, 14 (1), 1079.

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