本文要点：第二近红外（NIR-II，1000-1700 nm）窗口荧光成像引导的光热治疗探针有望用于精确的癌症光治疗诊断学。然而，目前报道的大多数探针在单个分子中没有表现出高NIR-II荧光亮度（摩尔吸收系数（ε）×量子产率（QY））和光热性能（ε×光热转换效率（PCE））。本文报道了一种解决这一挑战的通用策略，即通过制备具有刚性分子骨架和柔性侧基的大π偶联分子（BNDI-Me）。所提出的BNDI-Me纳米探针提高了ε，同时优化了其QY和PCE。因此，高NIR-II荧光亮度（ε × QY = 2296 m−1厘米−1）和强光热性能（ε×PCE = 82 000）成功地掺入单个小分子中，并且这两个参数中的任何一个都优于目前最好的荧光或光热探针。因此，在全身低注射剂量下获得了优越的体内NIR-II成像效果和高光热肿瘤抑制率（81.2%）。

背景：在单个探针中集成高分辨率的近红外二区（NIR-II，1.0-1.7μm）荧光成像和时空可控的发热，特别是生物相容性和易于重复的有机小分子，为非侵入性和精确的光治疗诊断学方面提供巨大的潜力。目前的NIR-II荧光基团设计策略侧重于通过结合电子供体（D）和受体（A）单元来创建强大的分子内电荷转移（ICT）分子骨架。通常，由共价单键连接的D/A亚基天然喜欢灵活的分子内旋转，这不仅有利于π系统较差的轨道重叠，导致低ε，而且在强极性水生物环境中将柔性骨架驱动到扭曲的ICT状态，以促进激发态的非辐射衰变，导致相对较低的QY和高的PCE。目前流行的改善QY的策略包括将具有立体旋转阻碍的D与分子骨架结合，以减少灵活的分子内旋转。这可能会将QY从1%提高到10%以上，同时将ε从104降低至 ≈103 m−1厘米−1，荧光亮度仅略有提高。本文通过制造具有刚性分子骨架和柔性侧基的大π偶联小分子（BNDI-Me）将高NIR-II荧光亮度和光热性能结合到单个分子中（方案1）。

方案1

研究内容：

1、 分子设计与合成

BNDI-H和BNDI-Me的分子设计如方案1所示。之所以选择NDI，是因为它具有刚性的大π偶联分子骨架，没有强烈的ICT效应。新的大π偶联分子（BNDI-H）具有新设计：它是通过加宽NDI染料的共轭骨架合成的。BNDI-H发射出现在NIR-II窗口中，因为它具有较大的π共轭效应，而不是强烈的ICT效应。其分子骨架刚性且共轭，没有强烈的ICT效应，有利于激发态的辐射衰变，以确保分子水平上的高QY。然而，刚性和共轭分子骨架倾向于形成平面分子，导致聚集状态下强烈的分子间π-π相互作用，这导致严重的ACQ，QY显著降低，水中PCE高。为了克服这个问题，在BNDI-H中间插入了两个灵活的侧基（甲基）作为空间位阻基和运动亚基。作为空间位阻基团，这些甲基扭曲BNDI-H的平面以增加分子间空间并减少聚集，从而提高NIR-II荧光QY，但降低PCE。此外，作为运动亚基，这些甲基的运动有助于发热，从而抵消了由于聚集减少而导致的热量减少。因此，两个灵活的侧基优化了BNDI-Me NP的QY和PCE，以同时获得可观的QY和PCE。此外，BNDI-Me的刚性和共轭分子骨架确保了π系统丰富的轨道重叠，从而产生了高ε。最终，BNDI-Me获得了高ε，同时优化了水中的QY和PCE，在单个分子中结合了高NIR-II荧光亮度和强大的光热效应。

2、 光学特性

为了获得良好的水分散性和生物相容性，疏水性BNDI-H和BNDI-Me与两亲性聚合物F-127共沉淀，制备了BNDI-H NPs和BNDI-Me NPs。通过动态光散射（DLS）测量，发现BNDI-H NPs和BNDI-Me NPs的平均流体动力学直径分别为≈54和46 nm（图1a，b）。BNDI-H NPs和BNDI-Me NPs的透射电子显微镜（TEM）图像表现出良好的均匀球形貌（图1a，b插图）。为了验证BNDI-H和BNDI-Me没有强ICT效应，首先对不同溶剂极性的BNDI-H和BNDI-Me进行了经典的溶剂变色效应测试。如图1c-f所示，BNDI-H和BNDI-Me表现出预期的NIR-I吸收峰和NIR-II发射。随着溶剂极性从甲苯增加到二甲基甲酰胺，BNDI-H（图1d）和BNDI-Me（图1f）的荧光峰仅略有变化。更重要的是，当溶剂极性增加时，它们的荧光峰表现出随机变化而不是渐进式红移（图1g）。这与溶剂极性增加时强ICT分子的荧光峰逐渐向长波长偏移的现象相矛盾。此外，斯托克斯位移（ν̃abs–ν̃em）和溶剂极性参数（∆f）拟合，以根据Lippert-Mataga方程评估深色位移特征。如图1h所示，BNDI-H和BNDI-Me的∆f和斯托克斯位移线性关系的斜率分别为665和595 cm-1，这显著低于所报告的强ICT分子的值。这些光谱特征表明，BNDI-H和BNDI-Me都没有表现出强烈的ICT效应。因此，BNDI-H和BNDI-Me是基于大π共轭而不是强烈的ICT效应实现NIR-II发射。这可以克服强ICT分子的原生限制。其次，研究了BNDI-H NPs和BNDI-Me NPs的光学性质。如图1i所示，两种NP均显示出广泛的吸收，范围从600到1200nm。BNDI-H NPs和BNDI-Me NPs分别在≈873和859 nm处表现出主要吸收峰，肩峰分别在991和944 nm处出现。BNDI-H NP在其主要吸收峰处的ε值被确定为1.34×105和BNDI-Me NP为1.64 × 105m−1∙厘米−1（图1j），比在水中的强ICT分子高一两个数量级（≈103–104m−1∙厘米−1）和花青（≈104m−1∙厘米−1），从而反映了大多环π共轭分子在光吸收能力方面的优势。此外，尽管它们在808 nm处的吸收（治疗诊断学常用的激发波长）明显弱于其主峰吸收（图1i），但ε仍然高达6.48×104和8.83 × 104m−1∙厘米−1分别为BNDI-H NP和BNDI-Me NP（图1j）。在808 nm激光激发下，在水溶液中分别观察到BNDI-H NPs和BNDI-Me NPs的发射峰（图1k）。BNDI-H NPs的荧光强度明显弱于摩尔浓度相同的BNDI-Me NPs，这与它们的NIR-II荧光图像一致（图1k插图）。此外，还评估了他们的NIR-II荧光QY。BNDI-Me NPs（2296）的ε×QY值是BNDI-H NPs（80.4）的≈28.6倍，明显高于先前报道的大多数具有高荧光亮度的NIR-II荧光团（图1m）。与美国食品和药物管理局批准的吲哚菁绿（ICG）中的严重光漂白相比（图1l），BNDI-H NPs和BNDI-Me NPs的荧光强度在连续808 nm（1 W cm）下表现出可忽略不计的衰减−2）照射30分钟，从而表现出优异的光稳定性。

图1

3、 光热性质

研究两种NPs的光热特性，使用临床批准的ICG作为对照。如图2a，b所示，当NPs和ICG以相同浓度存在时，发现ICG的溶液温度为40℃，由于其光稳定性差，激光照射4分钟后开始降低（图2a顶部）。即使浓度加倍，ICG的溶液温度在6分钟时也只能达到49℃，然后降低（图2a下）。相比之下，两种NPs的溶液温度持续升高（图2b），最高温度明显高于ICG。这表明两种NP在光热疗法（PTT）方面均优于ICG。此外，在808 nm激光照射下测试了BNDI-H NPs和BNDI-Me NPs的浓度和激光功率密度相关的温度变化曲线。在808 nm激光（1Wcm−2，10分钟），当探针浓度从2.50×10−6增加至 2.50 × 10−5M时，BNDI-H NPs和BNDI-Me NPs的所有溶液温度（图2c，d）逐渐升高。在2.50 × 10−5M 时BNDI-H NPs和BNDI-Me NPs的最高温度分别为64.1和68℃。在对照实验中，纯水在808nm激光照射下的温度升高1.8℃（图2c，d）。此外，浓度为2.50×10−5M时在0.25至1 W cm-2的不同激光功率下研究了BNDI-H NPs和BNDI-Me NPs的温度变化（图2e，f）。两种NP的溶液温度随激光功率密度的增加而迅速升高。这些结果明确地证实了BNDI-H NPs和BNDI-Me NPs是有效的光热剂。根据先前报道的方法，在808 nm激光照射下，BNDI-H NPs和BNDI-Me NPs的PCE分别为52%和50%（图2g，h）。BNDI-H NPs和BNDI-Me NPs的4次加热/冷却循环表明它们具有良好的光热能力（图2i，j）。两种NPs的光热性能几乎没有衰减，证实了其优异的光热稳定性。吸收光谱和溶液颜色的变化可以忽略不计。最后，基于ε×PCE进一步评价了两种NPs的光热性能。分别计算出BNDI-H NP和BNDI-Me NP在其最大吸收波长下的ε×PCE值为6.97×104和8.20×104。更重要的是，BNDI-Me NPs的值明显高于先前报道的最佳有机光热探针（图2k），表明BNDI-Me NPs表现出更好的光热性能。

图2

4、 结合高荧光亮度和光热性能的可能光物理机制

与传统的以牺牲光热性能为代价提高荧光亮度的策略不同，上述实验数据表明，BNDI-Me NPs在保持可观PCE的同时提高了QY。为了证明可能的机制，我们首先对BNDI-H和BNDI-Me的电子云分布进行了密度泛函理论（DFT）计算（图3a）。如图3a所示，BNDI-H和BNDI-Me的最高占据分子轨道（HOMO）和最低未占据分子轨道（LUMO）几乎均匀地沿着共轭骨架离域，但它们不是主要位于局部单元上。它还证实BNDI-H和BNDI-Me没有强烈的ICT效应，与经典的溶剂变色效应测试一致（图1c-h）。BNDI-H的HOMO、LUMO和带隙分别为−5.04、−3.50和1.54 eV。然而，与BNDI-H相比，BNDI-Me表现出较低的HOMO（-5.11 eV），较高的LUMO和更高的带隙（1.73 eV），这是BNDI-Me吸收光谱中蓝移的特征，与光谱数据一致（图1c，e）。为了确认两个柔性甲基作为空间位阻基团形成非平面BNDI-Me，进一步计算了分子的优化基态几何形状。BNDI-H在NDI单元与其核心之间表现出3.2°和3.1°的小二面角（图3a（向下））。然而，BNDI-Me表现出更大的二面角，分别为24.5°和29.9°，表明BNDI-Me表现出非平面构象。因此，这些数据表明，两个甲基作为空间位阻在BNDI-Me中引起了非平面构象。这些数据表明，两个柔性甲基作为空间位阻形成非平面BNDI-Me可以有效增加纳米颗粒中的分子间空间，从而比平面BNDI-H减弱ACQ效应，提高BNDI-Me NPs的质量。为了进一步了解BNDI-H NPs和BNDI-Me NPs的辐射和非辐射特性，通过飞秒瞬态吸收（fs-TA）光谱测量研究了两种NPs的激发态动力学。根据稳态吸收光谱（图1i）和病后双热诊断应用，我们使用800 nm脉冲激光器作为激发激光器来研究两种NPs的fs-TA光谱。通常，基态漂白（GSB）和受激发射（SE）通常表现出负面信号。激发态吸收（ESA）通常表现出正信号。根据稳态吸收光谱（图1i），应将突出的负信号分配给GSB（图3c，d）。为了进一步获得更多细节，分别从图3c，d中提取了两个NPs在选定衰变时间的fs-TA光谱（图3e，f）。随着延迟时间的增加，GSB和ESA信号均逐渐减小，BNDI-H NPs的衰变基本在65 ps以内结束，BNDI-Me NPs的衰变在200 ps以内结束，排除了其他新物种的出现（图3e，f）。BNDI-H NP在868 nm处的GSB衰减过程和BNDI-Me NP在854 nm处的GSB衰变过程如图3g所示，BNDI-H NPs的非辐射衰变通道显示出相当短的寿命，为1.23 ps（τ1）和13.4 ps（τ2）的激发群体，相应振幅为28.8%（A1）和71.2%（A2）。对于BNDI-Me NP，非辐射衰变通道耗散的寿命相当短，为2.97 ps（τ1）和 48.7 ps（τ2）的激发群体，相应振幅为45.4%（A1）和 54.6%（A2）。

图3

5、 NIR-II 体内荧光成像

BNDI-Me NPs表现出极高的NIR-II荧光亮度，在低全身注射剂量下提高荧光成像质量具有巨大潜力。为了评估BNDI-Me NPs在体内的NIR-II荧光成像性能，我们首先研究了BNDI-Me NPs的潜在毒性。PBS和BNDI-Me NPs（100 μL，0.5 mg mL−1）静脉注射到健康小鼠中。然后处死小鼠，并在注射后1，21天提取主要器官进行苏木精和伊红（H&E）染色。与PBS处理的小鼠相比，两组小鼠在主要器官中未观察到明显差异，表明BNDI-Me NPs未引起主要器官的明显组织学异常或病变。因此，BNDI-Me NPs具有良好的生物相容性，适用于体内成像。在注射BNDI-Me NPs后5分钟对全身进行NIR-II荧光成像（图4a）。同时，后肢脉管系统的血管表现出高信噪比（SBR = 3.54和3.50）和半峰时短全宽（FWHM = 0.398和0.369 mm），显示出高空间分辨率成像特征（图4b，c）。此外，即使在注射BNDI-Me NPs后11小时，后肢脉管系统仍然清晰可见，从而实现了动态脉管系统的长期观察。此外，由于BNDI-Me NPs通过增强的通透性和保留效应被动靶向，肿瘤区域的NIR-II荧光信号随着时间的推移逐渐增加，并且在注射BNDI-Me NPs后≈48 h观察到肿瘤中肿瘤与正常组织（T/NT）比值≈8.7的最大积累（图4d，此外，即使在体内也可以清楚地观察到肝脏和脾脏的形状（图4d），因为高荧光亮度增加了组织的成像深度和分辨率比，表明BNDI-Me NPs的高质量成像能力。随后，处死4T1荷瘤小鼠;在肝脾中观察到强烈的NIR-II荧光信号，在肺、心脏和肾脏中观察到相对较差的NIR-II荧光信号，表明肝胆系统是BNDI-Me NPs的清除路径（图4f，g）。这些结果表明，即使在低全身注射剂量下，BNDI-Me NPs作为NIR-II荧光造影剂在肿瘤诊断中也有潜力。

图4

6、 肿瘤的光热性质

为了评价BNDI-Me NPs在体内的光热性能，首先在细胞水平上分析了它们的光毒性和暗毒性。应用3-（4，5-二甲基-2-噻唑基）-2，5-二苯基-2-H-四唑溴化物（MTT）测定来研究BNDI-Me NPs在Hela和4T1癌细胞中的潜在细胞毒性和PTT作用（图5a）。在没有激光照射的情况下观察到高细胞活力，表明它们具有出色的生物相容性。相反，随着BNDI-Me NPs浓度的增加，BNDI-Me NP处理的Hela和4T1细胞在808 nm激光照射10分钟（0.3 W cm−2）下存活率降低。它们的生存能力分别下降到16.1%和13.9%，浓度为2.0×10−5M。此外，还进行了活细胞和死细胞染色测试，通过使用钙黄绿素-乙酰氧基甲基（钙黄绿素-AM）和碘化丙啶（PI）共染色来区分活细胞（绿色荧光）和死细胞（红色荧光）。如图5b所示，对照组中几乎所有细胞都被绿色荧光染色。然而，在用808nm激光处理的实验组中，大多数细胞被红色荧光染色，这表明这些是死细胞。进一步评估了BNDI-Me NPs在肿瘤组织中的PTT作用。接种异种移植4T1肿瘤的小鼠（n=5）分为以下四组：对照组（仅用PBS，BNDI-Me NPs（100μL，0.5mg mL−1），或 PBS + 808 nm 激光照射 （0.3 W cm−2））和实验组（BNDI-Me NPs（100 μL，0.5 mg mL−1） + 808 nm 激光照射 （0.3 W cm−2)).BNDI-MeNPs（100 μL， 0.5 mg mL−1）通过尾静脉注射到4T1荷瘤小鼠中。根据肿瘤NIR-II成像过程中获得的BNDI-Me NPs的最大积累时间，我们进行了808 nm（0.3 W cm−2）的PTT激光照射在注射BNDI-Me NPs后48小时照射肿瘤部位。记录照射过程中肿瘤区域的温度变化和热成像（图5c）。BNDI-Me NPs + 808 nm组表现出快速的温度生长，在10 min内升至62.2 °C，可以强力杀死癌细胞（图5d）。相比之下，PBS + 808 nm组在激光照射下仅表现出轻微的温度升高，最高温度为36.9 °C，这进一步证明了BNDI-Me NPs的有效PTT效应。在接下来的14天PTT期间，每2天记录一次所有组小鼠的肿瘤体积和体重。我们观察到，随着时间的流逝，实验组的肿瘤体积明显减少，对照组的肿瘤体积稳步快速增长。这表明BNDI-Me NP诱导的PTT可以有效抑制肿瘤（图5e）。PTT治疗14天后，切除主要器官和肿瘤组织。BNDI-Me NPs+808 nm组的肿瘤抑制率（81.2%）明显高于其他组（图5f，g），从而证明了BNDI-Me NPs的高抗肿瘤作用。紧接着，通过苏木精-伊红（H&E）染色和末端转移酶UTP切口末端标记（TUNEL）测定研究了所有组的细胞状态和肿瘤凋亡；实验组的肿瘤细胞比对照组的肿瘤细胞表现出更高的死亡和凋亡率（图5h）。

图5

总结：本文通过制造具有刚性骨架和柔性侧基的大π偶联分子，在低全身注射剂量下将强大的NIR-II荧光亮度和光热性能结合到单个小分子（BNDI-Me）中。该策略在优化QY和PCE的同时提高了光吸收，这有助于在单个分子中结合高NIR-II荧光亮度和强光热效应，这两者都明显优于以前的研究。

参考文献

Li, Y.; Tang, Y.; Hu, W.; Wang, Z.; Li, X.; Lu, X.; Chen, S.; Huang, W.; Fan, Q., Incorporation of Robust NIR-II Fluorescence Brightness and Photothermal Performance in a Single Large pi-Conjugated Molecule for Phototheranostics. Adv Sci (Weinh) 2023, 10 (3), e2204695.

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