本文要点：半导体聚合物因其优良的光学特性，在癌症光疗方面具有广阔的应用前景；然而，其低生物降解性阻碍了临床应用。本文报道了一种用于NIR-II荧光生物成像、光动力免疫治疗和光活化化疗的可生物降解仿半导体聚合物PSP。以及另一个对活性氧(ROS)有响应，侧链连有阿霉素的聚合物PEDOX。两个聚合物共组装为NP@PEDOX/PSP。NP@PEDOX/PSP可以在肿瘤部位积累，808nm激光照射下产生ROS。ROS可以破坏PEDOX中的硫缩酮键，导致PEDOX快速释放阿霉素。PEDOX和PSP都被细胞内谷胱甘肽牲降解，导致NP@PEDOX/PSP的解离。
背景：半导体聚合物（SP）具有良好的光学性质,能产生ROS。但生物难以降解SP，使其生物相容性不高。为解决这个问题，SP经常与其他生物可降解聚合物进行物理共组装，或在其侧链上用生物相容性聚合物进行化学修饰。虽然该策略通过减少SP的数量，提高了SP的兼容性，但仍不能避免不可降解SP的使用，使得长期的生物安全问题尚未得到解决。另一方面，SP单独依赖ROS的PDT作用，对杀死肿瘤细胞效果不佳。所以，目前迫切需要具有生物降解性，且具有多种治疗作用的SP替代品。
研究内容：作者通过将带有荧光探针的聚合物PSP和阿霉素聚合物PEDOX组装成纳米颗粒，实现NIR-II区荧光成像，PDT治疗，免疫治疗和光激活化疗。PSP的主链上有BODIPY为母核的荧光探针以及二硫键，通过GSH破坏二硫键，实现生物降解。而PEDOX的侧链上有化疗药物阿霉素(DOX)，对ROS响应的硫缩酮键把它连接到主链上，当PSP产生ROS时ROS破坏硫缩酮键，释放DOX产生化疗作用。而根据报道，PDT可激活体内的肿瘤免疫效应，实现免疫治疗。（Figure1）
Figure1
PSP的合成路线如Fig.2A所示。作者合成了含有双硫键的PSP和不含有双硫键的PSP-C，对比二者的光学性质。它们的吸收和发射曲线区别不大（Figure.2BC），但是PSP-C的吸光吸收更高。作者还评价了两者产生ROS的速度，利用DPBF接触ROS后，415nm上的吸收峰降低的性质，通过评价吸光度降低的速度评价ROS产生的速度。如Figure.2DE所示，PSP-C的斜率更高，ROS产生速度更快，这可能与其吸光系数更大有关。
Figure2
作者继续验证聚合物与硫醇的反应性。如Figure.3AB所示，通过ESI-MS结果可得，M3a与GSH孵育得到了GSH加合物，说明GSH可成功打断双硫键，对聚合物有生物降解作用。为了进一步验证，作者将M3a与另一种硫醇分子，巯基乙酸(MCA)反应，ESI-MS和H-NMR 结果显示两者可以加合(Figure.3CD)。通过将PSP与GSH孵育，PSP在凝胶渗透色谱中的洗脱时间从18.88 min逐渐增加到22.93 min(Figure3.E)，表明GSH可以降解PSP。
Figure3
随后，PSP和PEDOX通过以1：10的比例自组装成NP@PEDOX/PSP。利用TEM进一步观察NP@PEDOX/PSP的形态（Figure.4A)。NP@PEDOX/PSP分布均匀，呈球形形态。DLS进一步表征结果表明，NP@PEDOX/PSP的平均水动力直径为70nm。相比之下，作者制备了仅用PEDOX自组装的纳米颗粒(NPPEDOX)和用PSP自组装的纳米颗粒(NP-PSP)。NP-PEDOX和NP-PSP的平均水动力直径分别为74和103nm(Figure.4B)。光学性质测定结果表明，NP@PEDOX/PSP在504nm和607nm处有两个显著的吸收峰，分别归属于DOX和PSP的吸收峰(Figure.4C)，在1050和1054nm处均有主要的发射峰(Figure.4D)。此外，DOX和NP-PEDOX具有相似的吸收光谱，表明自组装对NP-PEDOX的吸收光谱的影响可以忽略不计。采用ESR对光激发产生的单线氧进行监测，使用TEMP作为探针，与单独的NP@PEDOX/PSP相比，光照射下NP@PEDOX/PSP的峰值强度增加了59.3%(Figure.4E)，表明激光照射下ROS生成。作者使用ESI-MS来监测释放的DOX，在NP@PEDOX/PSP+L的混合物中发现了一个m/z 543.31的典型峰，可以归值给释放的DOX(Figure.4F)。说明单线氧可以通过破坏NP@PEDOX/PSP中的硫缩酮键来进一步触发DOX的释放。用HPLC进一步监测DOX的累积释放量，在48 h达到最大值65%(Figure.4G)。为了证明PEDOX对GSH响应性，作者采用凝胶渗透色谱(GPC)来监测分子量的变化。结果显示，PEDOX的洗脱时间逐渐增加(Figure.4H)，说明GSH孵育后PEDOX的分子量降低，PEDOX可受GSH降解。随后，用DLS监测GSH孵育后NP@PEDOX/PSP直径的变化。如Figure.4I所示，孵育24h后NP@PEDOX/PSP的直径逐渐增大，表明了GSH诱导NP@PEDOX/PSP的解离。
Figure4
接下来作者检测纳米粒子的抗癌作用。MTT实验发现，NP@PEDOX/PSP+L对4T1和A549癌细胞具有显著的细胞杀伤作用，生长抑制率为84.67%和79.39%，分别是单独的NP@PEDOX/PSP的2.54倍和2.35倍(Figure.5A)。作者还使用DCFH-DA检测纳米粒子产生的ROS，如果有ROS产生，DCFH-DA会产生绿色，从Figure.5B中可看出，808nm激光处理下NP-PSP+L和NP@PEDOX/PSP+L处理的细胞显示出强烈的绿色荧光，表明PSP能有效地生成ROS(Figure.5B)。通过CLSM检测，进一步观察了NP@PEDOX/PSP的抗癌效果。结果表明，NP-PSP处理后的细胞具有较强的绿色荧光(Calcein-AM，细胞存活)而几乎没有红色荧光（碘化丙啶，细胞死亡），说明NP-PSP没有明显的毒性。当PEDOX存在时可看到少许红色荧光，这是因为DOX的化学作用。光照后NP-PSP+L和NP@PEDOX/PSP+L组都出现大量红色荧光，说明光照后对癌细胞的杀伤力大幅提升(Figure.5C)。
Figure5
最后作者进行了纳米粒子的体内实验。注射24h后肿瘤部位的荧光强度达到最大，NP@PEDOX/PSP+L组可成功抑制肿瘤的生长。HE染色后发现NP-PSP+L和NP@PEDOX/PSP+L组都出现细胞坏死（Figure.6）。作者为了证明PDT可引发肿瘤免疫反应，利用流式细胞仪检测肿瘤组织微环境的免疫细胞种类，发现PDT后树突状细胞增多，CD8T细胞增多，巨噬细胞从M2的免疫抑制状态转向M1的免疫激活状态，脾和淋巴结中的树突状细胞和T细胞也有所增加（Figure.7）。
Figure6
Figure7
总结：作者开发了自牺牲可生物降解的NP@PEDOX/PSP，可以触发ROS的产生和DOX的释放，用于联合NIR-II荧光生物成像、光动力刺激的免疫治疗和光激发的化学治疗。GSH可以有效地降解PEDOX和PSP。NP@PEDOX/PSP+L能产生单线氧，诱导DOX的快速释放。作者发现，经NP@PEDOX/PSP+L处理后的4T1细胞和A549细胞可以被有效杀死。在体内，NP@PEDOX/PSP在NIR-II生物成像中表现出良好的NIR-II荧光信号，可有效抑制4T1肿瘤的生长，且无明显副作用。NP@PEDOX/PSP+L的PDT作用可招募树突状细胞，促进抗原特异性的CTLs到肿瘤组织微环境，以激活抗肿瘤免疫反应。
参考文献
https://doi.org/10.1002/adma.202203820.
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