本文要点：光热疗法(PTT)是一种通过局部热疗诱导细胞凋亡和坏死的非侵入性治疗方法，具有有效肿瘤杀伤力，但是NIR-II PTT治疗作用的增加依赖于非辐射衰减，这会牺牲荧光(FL)生物成像的荧光亮度。本文合成了四种NIR-II黄蒽染料(CL1-CL4)，在1064nm激发下，最大发射波长超过1200nm。其中，CL4与FBS络合后荧光量子产率最大，能够清晰分辨出肿瘤血管，而且光热转换率（PCE）高达36%，可用于PTT治疗，成功在NIR-II窗口实现荧光成像和光热治疗在的平衡利用。

方案1：CL4/FBS的构建示意图、平衡利用荧光和光热用于肿瘤血管造影和光热治疗。

CL4与FBS络合后，在1064nm的激光照射下，可以同时实现在NIR-II窗口中的荧光成像和PTT治疗。

图1：a) CLs的分子结构。b) CLs的HOMO轨道和LUMO轨道。c)通过密度泛函理论(DFT)计算优化CLs的几何形状。d)CLs在氯仿中的吸收光谱。e)氯仿中CLs在1064 nm激发下的归一化发射光谱。

表1：CLs的光物理性质和DFT计算

首先，研究CLs的光谱性质。CLs在1200 nm附近有较宽的吸收带，并且在1064nm的激发下，CLs的最大发射波长均超过1200 nm (表1、图1d和1e)。这主要归因于两个氧杂蒽核与聚甲基桥的融合，导致分子内电荷转移(ICT)效应显著增强。其中CL4具有最大的Egap、分子扭曲和荧光量子产率(图1b、1c和表1)。这是因为将CF3引入巯基的邻位，导致分子内空间位阻大，削弱了分子的自由旋转，增加了辐射衰减。

图2：a) CL4与FBS在1064nm激发下孵育0-120 min，随时间变化的发射光谱。b) CLs与FBS孵育0-120分钟，CL2 ~ CL4荧光强度的变化。c-d) CL4/FBS和CL4-水的吸收光谱(c)和发射光谱(d)。e) CL4/ FBS的透射电镜(TEM)图像。f-g) CL4/FBS和FBS的水动力直径(f)和zeta电位(g)。h) CL4/FBS的pH稳定性。i) CL4/FBS和ICG 的光稳定性。

接下来，研究CLs/FBS的性质。将CLs与FBS络合，可以提高自身的荧光强度和亲水性。如图2b-2d所示，与FBS络合后，CLs的最大吸收波长发生红移，最大发射波长略微蓝移，其中CL4的荧光强度比CL2或CL3提高了3倍以上，这可能归因于CL4的分子内旋转容易受到限制。接着进一步表征CLs/FBS的基本性质，如图2e-2g所示，CL4/FBS的粒径均匀，TEM测定的粒径约为40nm，DLS测得的粒径为64nm；并且CL4/FBS的电动电势与FBS相当。这些结果表明CLs/FBS具有通过高渗透长滞留(EPR)效应实现被动靶向肿瘤的可能性。此外，CL4/FBS还具有PH稳定性和光稳定性(图2h和图2i)。

图3：a) CL4/FBS在1064 nm激光照射下的升温曲线。b)冷却时间与的线性关系。c)在不同时间下，CL4/FBS随着浓度变化的温度曲线。d)在1064 nm激光照射10分钟后，CL4/FBS浓度依赖性的热图像。e)在不同激光功率下，CL4/FBS随时间变化的温度曲线。f)在不同激光功率连续照射30 min下，CL4/FBS的光稳定性。g) CL4/FBS在5个加热-冷却循环中的光热稳定性。

接着，研究CL4/FBS的光热性能。如图3a-3b所示，CL4/FBS的PCE高达36%，而CL4在水中的PCE仅为19%，所以与FBS络合不仅提高荧光强度，也提高了PTT的治疗效果。如图3c-3d所示，在同样条件激光照射下，水温度只升高了9.8℃，而CL4/FBS温度上升更显著，并且表现出浓度依赖性。同样，随着激光功率的增加，CL4/FBS溶液温度也随之增加(图3e)。这些结果都表明了CL4/FBS具有良好的体外光热性能。另外，CL4/FBS还具有良好的光热稳定性(图3f和3g)，可以继续进一步PTT的体外和体内实验。

图4：a) 4T1细胞与CL4/FBS孵育4 h后，明场、核染色和 NIR-II FL的图像。b) 与CL4/FBS孵育，无/有激光照射的4T1细胞的存活率。c)不同条件下活/死细胞共染色的共聚焦图像。

紧接着，在体外研究CL4/FBS的PTT效果。首先研究CL4/FBS的细胞摄取，如图4a所示，与CL4/FBS孵育4h之后，4T1细胞中可观察到明亮的NIR-II荧光，而细胞核中没有发现荧光，说明CL4/FBS具有良好的细胞摄取能力。随后研究CL4/FBS的细胞毒性，如图4b所示，CL4/FBS具有良好的生物相容性，而与CL4/FBS孵育并在激光照射下4T1细胞的死亡率逐渐增加，说明CL4/FBS具有出色的激光触发的热效应。另外，如图4c所示，只有PTT组，表现出明显的红色荧光，说明细胞被有效杀灭。这些结果表明，CL4/FBS具有良好的光热治疗效果。

图5：a）静脉注射CL4/FBS后0、20、30、40min肿瘤血管的NIR-II FL。b-d）(a)中线1、线2和线3横截面的强度分布图。e)静脉注射CL4/FBS后，(a)中A区和B区分别在20、30和40 min的平均荧光强度。

接下来，通过NIR-II FL研究肿瘤血管最基本的性质。现有的非侵入性成像方法难以获得肿瘤血管的本质特征。然而如图5a所示，静脉注射CL4/FBS后，肿瘤血管清晰明亮。线1和线2是肿瘤血管的横切面，线3是正常血管的横切面，对比它们的半峰宽(FWHM)，可以看出在肿瘤发生的前期的血管比正常血管要细得多(5b-5d)。另外，如图5e所示，A区的荧光强度低于B区，这归因于肿瘤血管的异常渗漏结构，表明肿瘤穿透具有复杂的异质性。这些结果表明CL4/FBS具有良好的NIR-II肿瘤血管造影的能力。

图6：a) 4T1荷瘤小鼠静脉注射CL4/FBS和CL4后全身NIR-II 荧光成像，以及不同时间静脉注射CL4/FBS后肿瘤的放大图。b) (a)中肿瘤NIR-II FL强度的量化。c) 静脉注射CL4/FBS和CL4 48小时后，主要器官和肿瘤离体NIR-II的荧光成像。d）(c)中主要器官和肿瘤强度的量化。

接下来，研究CL4/FBS在肿瘤中的富集。如图6a-6b所示，静脉注射CL4/FBS后，肿瘤亮度逐渐升高，注射32 h后肿瘤亮度最大，而静脉注射CL4后，在肿瘤部位几乎没有观察到NIR-II荧光。之后研究小鼠的主要器官和肿瘤，发现CL4/FBS比CL4更有效地在肿瘤中富集；此外，CL4/FBS和CL4在肝脏和脾脏均有积累，表明可能它们在体内的代谢途径是肝胆系统(图6c-d)。这些结果表明CL4/FBS可作为一种有效的NIR-II荧光剂用于肿瘤成像。

图7：a）激光组和PTT组随时间变化的小鼠时间分辨红外热像图。b）不同组别肿瘤温度变化。c）不同治疗后14 天内小鼠肿瘤体积的变化。d）不同处理后第0天和第14天的小鼠照片。e）第14天肿瘤的照片。f）第14天肿瘤的重量。g）不同处理14天后的小鼠体重。h）不同治疗后肿瘤切片的H&E、Ki67、TUNEL染色图像。

最后，进行体内NIR-II PTT研究。按治疗方式分为4组:①对照组；②CL4/FBS组；③激光组;④PTT组。如图7a-7b所示，PTT组肿瘤温度迅速升高，而其他组肿瘤温度没有明显变化。接着，检测肿瘤的体积和重量，发现只有PTT组的肿瘤生长明显受到抑制(图7c-7f)。说明CL4/FBS的PTT具有良好的肿瘤抑制活性。并且如图7g所示，在治疗期间，各组小鼠体重变化可以忽略不计，说明各组都没有明显不良反应。接下来，进一步探讨PTT对肿瘤生长的抑制机制，如图7h所示，PTT组肿瘤组织H&E染色图像显示出肿瘤细胞严重凋亡和坏死，Ki67和TUNEL免疫荧光染色图像显示了肿瘤细胞轻度增殖和明显的凋亡信号，结果证实了CL4/FBS的PTT对肿瘤有较好的抑制作用。

总结：作者合成了4种发射波长超过1200 nm的NIR-II新型黄蒽染料CLs。其中CL4与FBS络合后，具有最强的荧光强度和最高的PCE。在NIR-II FL成像中，可以清晰呈现出肿瘤血管，并且可以明显抑制肿瘤的生长，成功实现了平衡利用荧光成像和PTT治疗。

参考文献

https://doi.org/10.1002/smll.202202078.

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