本文要点：传统的免疫探针具有从可见光到近红外（NIR-I，650-900 nm）区域的吸收能力。近红外二区（NIR-II，1000-1700 nm）窗口由于更深的穿透深度和可视化而引起了很多关注。本文报道一种基于人源纳米抗体的免疫荧光探针（ICGM-n501）设计与合成，实现了首次通过抗原增强荧光发射的NIR-II生物成像。通过将ICG类似物（ICGM，马来酰亚胺修饰）与肿瘤特异性的n501进行定点偶联，ICGM-n501以高分辨率（0.21 mm）实时监测基于抗体的生物制剂的腹部运输途径，在腹膜转移瘤的生物成像中以更低的剂量（0.21μmol·kg−1）呈现比生物发光剂D-荧光素更好的准确性。在这项工作中，ICGM-n501展示了在临床手术指导中的潜力，提供了下一代免疫测定生物制剂的模板。

n501被设计为用于抗体-药物偶联物和诊断试剂的功能性小分子的载体。作者先前基于非免疫健康供体的外周B细胞创建了一个大型Fab噬菌体展示抗体库，并将筛选出的n501作为5T4靶向纳米体。其中一个位于功能区外的半胱氨酸残基用于特定药物偶联，该位点不会对该纳米体（n501）的功能造成干扰。SDS-PAGE得到了均匀绿色溶液（产量ICGM-n501 = 44.8%）（Figure 1D）。HPLC结果（Figure 1E）显示，ICGM-n501有较小的分子量（~501KDa），保留时间（10.65 min）与n501（10.64 min）相似，表明所得样品是稳定且均匀的溶液。同时在无TCEP（稳定剂）的PBS溶液中观察到n501的聚集和解离，表明ICGM的引入增强了n501结构的稳定性。

图1. ICGM-n501的设计、应用和特性。（A） ICGM、n501及其共轭产物ICGM-n501的结构示意图。（B–C）NIR-II生物成像系统和转移瘤时变生物成像过程的图示。（D） n501和ICGM-n501的SDS-PAGE（考马斯亮蓝染色）。（E） 不含稳定剂TCEP、1 mM TCEP和纯化产物ICGM-n501的n501的HPLC光谱。（F） 归一化NIR-I和NIR-II（插图）ICGM-n501（0.6μM）的荧光发射光谱以及紫外-可见吸收光谱。NIR-II荧光光谱收集波长为980 nm 长通滤波器。

本文选用5T4抗原作为转移瘤的靶标。n501（1 mM TCEP; IC50 = 0.54μM）和ICGM-n501（1 mM TCEP; IC50 = 0.22μM）显示出与抗原5T4的良好结合亲和力，而没有TCEP稳定的n501由于聚集而显示低亲和力（Figure 2A）。相比之下，ICGM、不相关的免疫试剂ICGM-TH（ICGM修饰的抗酪氨酸羟化酶单克隆抗体）和n118（靶向CD16a）即使在高浓度下也表现出低亲和力。这说明ICGM本身在抗原抗体结合过程中没有影响。ICGM-n501与5T4表达细胞的特异性亲和力通过流式细胞术测定评估。如Figure 2C所示，5T4抗原在卵巢癌PA-1和SKOV-3细胞系以及人肾上皮293 T细胞系中高表达，而在4T1细胞系中没有表达。当测试这些细胞系对 ICGM-n501 的摄取时（Figure 2C），卵巢癌 SKOV-3（3.8）和 PA-1（9.73）细胞系都呈现出相对较高的荧光强度。

高纯度的ICGM-n501促进了结合机理的研究。添加5T4抗原后，作者首次在NIR-II区域观察到ICGM-n501的特定荧光发射增强（Figure 2D），1050 nm处的荧光强度呈现出的非线性递增曲线（Figure 2D（插图））。将无关抗原s IL-15Rβ, gp140, mesothelin, Tim3- ecd, VEGF分别加入到含有ICGM-n501和饱和5T4抗原（0.267 μmol·L−1）的比色皿中（Figure 2D）,相应的荧光发射光谱几乎保持不变，1050 nm处的荧光发射强度保持不变，表明ICGM-n501和5T4之间存在特定的连接。然而，在没有5T4抗原的情况下，ICGM-n501的荧光光谱存在很大差异（Figure 2E）。

图2. ICGM-n501的体外生物特性。（A） 基于含或不含TCEP、ICGM-n501、ICGM、ICGM的n501的ELISA数据的结合能力评估将浓度梯度稀释至5T4抗原、H7N9 HA抗原的免疫剂TH-ICGM和N118作为阴性对照。误差条反映了标准差（SD）。（B） 通过流式细胞术分析5T4抗原在不同细胞系（4T1、SKOV-3、PA-1和293T；每孔1×106）中的表达抗体（5T4靶向抗体M603、无关抗体G12和PBS）结合能力评估。（C） 不同细胞对ICGM-n501（100 nM）的摄取量直线（4T1、SKOV-3、PA-1和293 T；每孔1×105），（D）ICGM-n501（0.532μmol L）的NIR-II荧光发射光谱− 1.)添加5T4抗原（4.45nmol L− 1/次），以及ICGM-n501在1050 nm处的5T4抗原浓度依赖性荧光强度（插图）。（E） 荧光发射光谱添加IL-15Rβ、gp140、间皮素、Tim3 ecd和VEGF抗原（4.45 nmol L）后，饱和ICGM-n501结合5T4抗原− 1.). 插图显示荧光灯添加不同抗原后，在1050 nm处发射ICGM-n501。（E） 添加5T4、IL-15Rβ、gp140、间皮素、Tim3-ecd和VEGF抗原（4.45 nmol L− 1.). 插图显示了添加不同抗原后ICGM-n501在1050 nm处荧光发射变化的比率与仅ICGM-n501相比。使用980 nm长通滤波器收集NIR-II荧光光谱。

作者应用 DFT（密度泛函理论）和时间相关的DFT计算来系统地理解荧光增强现象。ICGM与n501的结合可能通过TICT过程促进荧光强度，同时也可能涉及其他变化：ICGM-n501与5T4抗原在膜上的J聚集。因为根据蛋白质结构，5T4抗原具有作为固相使ICGM-n501以有顺序的拉伸。这种现象的机制总结如下（Figure 3G）。n501与ICGM的共轭使2-4 Bond保持扭曲角度，以提高TICT过程的频率并发射更长的波长。加强Bond 1也略微提升了量子产率。ICGM-n501与5T4抗原进一步在膜上结合产生固定排列，从而提高了膜上5T4抗原的J聚集概率。在此过程中，5T4抗原作为染料之间分子间能量转移的固相发挥作用，从而促进了荧光发射强度以及波长的红移。

图3. 抗原促进荧光强度增强的机理分析。（A） 用于高斯计算的ICGM和ICGM cys的化学结构。（B） ICGM和ICGM CY的HOMOs和LUMOs。（C） 当键2扭转0时，ICGM和ICGM-cys的静电势面（ESP）0°, 55°, 和90°. （D） ICGM和ICGM-cys发生的TICT（扭曲分子内电荷转移）过程的图示。（E） 药物测试说明。（F） ICGM-n501（0.21μmol kg）后不同时间（30分钟、1小时、2小时、4小时、8小时、12小时、24小时和48小时）血清中ICGM-n501的浓度− 1.)静脉注射到健康小鼠。（G） ICGM-n501的详细荧光增强过程说明。

应用皮下肿瘤模型评估 ICGM-n501 的肿瘤内通路。如Figure 4B、C 所示，通过腹腔注射0.21 μmol kg-1 ICGM-n501后成功地观察到 ICGM-n501 的肿瘤通路。作为比较，基于D-荧光素的生物发光成像需要更多剂量。同时，ICGM-n501可以提供高分辨率（0.21 mm）图像。直观地观察到ICGM-n501的腹腔内递送途径，并观察到它通过各种类型的淋巴结吸收和转运（Figure 4B）。在Figure 4F中，将不同时间（0 min、12 min和158 min）的 NIR-II 生物成像结果转换为荷瘤小鼠的 3D 荧光强度统计模型，然后基于指示整个 NIR-II生物成像荧光强度的模型计算 2D 表面体积。2D荧光强度体积从0 min的184940（Figure 4F）增加到 371327（Figure 4G），最后在 926897（Figure 4H）结束。荧光强度随着 ICGM-n501 进入肿瘤区域而飙升，这是直观的证据表明ICGM-n501与5T4 抗原结合的作用促进了荧光发射的强度。与静脉注射相比，ICGM-n501通过腹膜内注射进入血流的时间更长。158 min时，NIR-II荧光描绘的肿瘤形状与基于D-荧光素生物发光的肿瘤形状一致。切除肿瘤并H&E染色分析（Figure 4I），显示与高斯2D拟合的肿瘤大小结果相似（9 mm×8 mm）（Figure 4H插图）。综上所述，ICGM-n501具有高分辨率和肿瘤靶向精确性。

图4. 通过ICGM-n501和D-荧光素进行皮下肿瘤生物成像。（A） 给雌性裸鼠（9周）注射0.21μmol kg− 1 ICGM-n501之前注射后（B）0分钟、（C）12分钟和（D）158分钟的布莱特菲尔德照片和腹部成像。还显示了相应的三维统计结构和二维高斯拟合曲线计算（F–H）。同一只小鼠注射D-荧光素（670μmol kg− 1） 585–735 nm（E）下生物发光成像前20分钟。在功率密度为2mw的情况下，使用1200 nm长通滤波器和808 nm激发激光进行NIR-II生物成像⋅厘米− 2.

腹膜转移（PM）通常发生在患有腹部器官癌症（如胃癌、卵巢癌、结肠直肠癌、阑尾癌和胰腺癌）的患者中，预后很差。因此，高精度靶向腹膜转移至关重要。目前，靶向叶酸受体的OTL-38（3期）和EC-17（1期）是卵巢癌手术助手仅有的两个临床候选，假阳性率为32.7%。ICGM-n501将扩大目标类别和延长成像窗口。首先通过生物发光确定了腹膜转移性肿瘤的位置（Figure 5A）。在Figure 5B中，腹部有七个明亮的圆形斑点，肝脏位置上方有另外两个薄弱点。如Figure 5D所示，ICGM-n501的荧光强度较高，荧光状区域呈不规则状，与H&E染色呈现的肿瘤形状一致（Figure 5H，5J-Q）。这些现象表明ICGM-n501在较低剂量 (0.21μmol·kg-1 ) 下显示出更高的准确性，部分原因是ICGM-n501-5T4结合的显著荧光增强。隐藏在器官中太深肉眼区分的肿瘤（Figure 5H）被ICGM-n501成功定位和描绘，但在无创生物成像中D-荧光素却达成目标。

图5. 通过ICGM-n501和D-荧光素进行腹膜转移瘤生物成像。将D-荧光素（670）腹腔注射给一只裸鼠（约9周）μmol kg− 1） 在近红外生物成像仪上以585–735 nm注入后20分钟，在亮场照片（A）和生物成像（B）之前。显示了相应的2D荧光强度统计图（F）。同一只小鼠静脉注射ICGM-n501（0.21μmol kg− 1） 注射后46分钟，在brightfield photo（C）和NIR-II生物成像（D）之前。相应的2D荧光强度统计映射如（I）所示。（E） D-荧光素和ICGM-n501的结构、外观和剂量说明。（G） 腹部开放的小鼠的亮场，肿瘤可见区域由橙色虚线环绕。（H，J-Q）ICGM  n501基于生物成像的组织切除和相应的免疫组化分析。在功率密度为2 mw的情况下，使用1200 nm长通滤波器和808 nm激发激光进行NIR-II生物成像⋅厘米− 2.

本文报告用于NIR-II转移性肿瘤生物成像的全人类荧光免疫探针(ICGM n501)。凭借ICGM-n501的均质特性，首次在体外和体内观察到由特异性抗原抗体结合引起的显著荧光发射增强，并推断出TICT和J聚合涉及的两步机制。ICGM-n501在皮下肿瘤模型中以高分辨率（0.21 mm）演示了基于抗体的生物制剂的淋巴转运，以低剂量精确定位腹膜转移性肿瘤中的微小病灶（1.38 mm）。总之，ICGM-n501 代表了一种强大的NIR-II生物成像剂、临床转移性肿瘤的诊断候选物和NIR-II 免疫探针的多功能设计模式。

参考文献

https://doi.org/10.1016/j.biomaterials.2022.121637

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