本文要点：NIR-Ⅱ荧光成像具有更少的组织散射和自发荧光，实现了更深的组织穿透深度和更高的分辨率。但是大多数有机NIR-Ⅱ荧光团具有较低的荧光量子产率和较差的药代动力学性质。传统上通过化学修饰来解决，但是不仅化学合成过程繁琐而且有些花菁类染料结构上没有可以修饰的单元。作者通过基因工程合成了一系列白蛋白片段和包含一个或者多个结构域的重组蛋白，这些白蛋白变体会保护插入的染料，使它们的荧光亮度提高。通过对白蛋白变体进行基因编辑，可以实现精准“定制”药代动力学；还可以通过生物功能小分子修饰，实现体内成像。

图1.复杂设计和结合机理的示意图

a）左：HSA的结构。DIIIa用绿色突出显示，DIIIb用橙色突出显示。右：DIIIa（绿色）和DIIIb（橙色）的分裂α-螺旋(h)结构。b）野生型白蛋白可以通过基因工程产生与花菁类染料结合的片段和重组蛋白，并且产生大小和亮度可调的复合体。将重组质粒DIII、DIIIa（包裹花菁类染料的最小功能单位）和TDIII（三个DIII序列串联）插入载体（巴斯德毕赤酵母：pPIC9载体）。c）生色团涂层可以用生物功能分子进行生物或化学修饰。b）花菁类染料与白蛋白变体相互作用的机理。左：机理涉及两个独立的阶段。第一阶段：将花菁类染料插入疏水蛋白口袋中，通过非共价键紧密结合。第二阶段：含氯的花菁类染料与蛋白质的特定残基形成共价键。中：含氯的花菁类染料在DIII中准确结合位置的3D结构。绿色（赖氨酸475）、紫（苯丙氨酸458）和灰色（精氨酸472和精氨酸484）代表参与第一阶段协同超分子相互作用的残基。右：结合袋中的Cys476被证明是结合残基。

HSA中有三个结构域（DⅠ、DⅡ、DⅢ），DⅢ结构域中有a、b两个亚基（图1a），花菁类染料插入DⅢa亚基的疏水口袋中，通过非共价键连接，含氯花菁类染料上的氯与疏水口袋中半胱氨酸467发生亲核取代反应，通过共价键连接（图1d）。利用毕赤酵母表达DⅢ、DⅢa、TDⅢ重组蛋白，与染料结合后产生不同的荧光强度和药代动力学（图1b）。还可以用生物功能小分子修饰蛋白质涂层，产生具有生物功能特性的长波长荧光团，便于用于体内成像。

图2.花菁类染料与DIII结合使荧光增强作用

a）IR-783@DIII的吸收光谱、NIR-Ⅰ发射光谱和NIR-Ⅱ发射光谱。Ab：吸收光谱；Si Em：使用硅相机记录的发射光谱；InGaAs Em：用InGaAs相机记录的发射光谱。b、c）IR-783@DIII（1：1）在室温（RT）和60℃下的NIR-I荧光增强在NIR-Ⅰ区域（b）和NIR-Ⅱ区域（c）。d、e）用电泳法分析IR-783与DⅠ、DⅡ、DⅢ、HSA、BSA混合物在白光下（d）和在>1000nm的荧光下。f）具有不同蛋白质与染料摩尔比的IR-783@DIII和IR-783@HSA的NIR-II图像。g）填充IR-783@DIII溶液的毛细管在1%磷脂中浸泡到不同深度的荧光图像。h）IR-783与DIII（上）或HSA（中）以及ICG与DIII（下）的动力学结合分析结果。i-k）与在PBS中游离染料的荧光强度相比，不同花菁类染料与BSA、HSA（i）、DⅠ、DⅡ、DⅢ（j）结合之后荧光强度增强的对比。

首先，筛选重组人血清白蛋白（HSA）的结构域，来确定花菁类染料与白蛋白准确的结合结构域。如图2a-c所示，当IR-783与DⅢ结构域结合的时候，在NIR-Ⅰ（发射峰在810nm）、NIR-Ⅱ（拖尾峰）的荧光强度增强，甚至高于IR-783与HSA混合物的荧光强度。如图2d、2e所示，电泳实验展现出一样的结果，这些实验表明DⅢ可能是IR-783的结合口袋。同时可以观察到随着IR-783的负载量，HSA和BSA的荧光强度降低，游离IR-783对应的NIR-Ⅱ的荧光强度增强。但是IR-783与DⅢ的摩尔比从1：1增加到3：1时，表现出相似的荧光强度。说明高负载量会使IR-783@HSA发生荧光淬灭，但是对IR-783@DⅢ没有影响。与NIR-I窗口相比，在NIR-II窗口中可以对IR-783@DIII进行更深层次的成像（图2g）。

接下来，研究一系列的花菁类染料，来确定与白蛋白紧密结合的染料。这一系列染料除了DiR之外，都与白蛋白具有高亲和力。如图2h所示，IR-783与DⅢ具有更高的结合亲和力，结合的更快，解离的更慢。如图2i所示，一部分染料与HSA和BSA结合之后，比起游离的染料荧光强度显著更强。进一步研究荧光增强是否与DⅢ结合有关系，这一系列染料与DⅢ结合之后，荧光强度或多或少的增加。结果表明，荧光强度与结合的姿势有关，而与高亲和力无关。

图3.花菁类染料与DIII相互作用的机理

a）UHPLC-MS分析表明，DIII与插入的花菁类染料之间形成了共价键。质量增加为691m/z，相当于IR-783去除Cl的分子量。b）含Cl和无Cl染料的核结构，有些花菁类染料不含红色基团。c）花菁类染料与DⅢ及其变体的相互作用有两个独立阶段。d）HSA与菁染料有两个结合部位：一个位于DⅠa的表面（游离的Cys34是唯一含有游离巯基的天然胱氨酸），另一个位于DIIIa的疏水口袋中（在Cys475形成共价键）。e）与HSA或BSA相比，大多数与DIII结合的花菁类染料的荧光强度都增强了（1.3-5.9倍）f）染料@HSA的荧光增强程度低于染料@DIII，这是因为与DI结合的染料对DIII疏水口袋中结合的荧光增强染料表现出分子内猝灭。g）TICT诱导IR-783（顶部）和ICG（底部）的NIR-I和NIR-II的DFT和TDDFT计算。h-j）蛋白质组学分析表明，Cys475有助于共价键的形成。含有染料修饰的半胱氨酸氨基酸的三电荷胰蛋白肽的MS/MS（i）和碎片质量（j）。用基于Orbitrap的质量分析仪(<0.5ppm)获得了完整的y系列离子(y1-y8)。这些离子被标记在光谱上，并被描绘在序列上。

如图3a所示，两者的分子量的差刚好是IR-783除去Cl的分子量，说明DIII与插入的花菁类染料之间形成了共价键。所以含氯的花菁染料通过共价键与DIII结合，而无氯的染料通过非共价的超分子相互作用与DIII结合（图3b、c）。接着研究了HSA与花菁类染料的结合，如图3d所示，HSA结构域存在两个独立的染料结合位点，一个是DⅠa亚结构域中cys34（对荧光增强没有贡献），一个是DⅢa亚结构域中的疏水口袋（类似于DⅢ上染料结合位点），在空间上靠的近，当蛋白高染料负载时会发生分子内淬灭，导致荧光强度降低（图2e、2f、3f）。如图3g所示，IR-783和ICG表现出类似的扭曲分子内电荷转移（TICT），这表明荧光增强不能归因于共价键的形成。接下来用鸟枪法蛋白组学研究花菁类染料与白蛋白之间反应机理，结果表明，Cys476残基存在疏水口袋中，含Cl的花菁类染料中的Cl可以与Cys476中的硫醇（SH-）发生亲核取代反应。所以DⅢ与花菁类染料相互作用分为两个阶段：第一阶段，染料插入DIII的疏水口袋并通过非共价相互作用与口袋结合，通过增强TICT来增强亮度；在第二阶段，cys476的SH-与染料的Cl-通过亲核取代形成“卡环”，稳定口袋中含氯的染料。

图4.与游离染料相比，染料@DIII显示出更好的药代动力学，也可以用靶向分子进行修饰

a）注射游离IR-783或IR-783@DIII的小鼠的NIR-II图像。Li：肝; Ki：肾脏; In：肠。b）肝和肾中游离IR-783和IR-783@DIII的信背比。c）注射IR-780@DIII或ICG@DIII小鼠的NIR-II图像。d）左：用生物功能分子TATE和PSMA-617编辑DIII涂层的过程示意图。右：游离IR-783、IR-783@DIII、IR-783@DIII-分子结合物和DⅢ的NIR-II图像。e、f）用UHPLC-MS分析证实PSMA-617或TATE成功修饰了DIII。（3-5个分子可成功偶联到1个DIII上）。g、h）过表达SSTR的AR42J细胞摄取IR-783@DIII-TATE的NIR-II显微镜图像（g）和过表达PSMA的PC3-PIP细胞摄取IR-783@DIII-PSMA-617的NIR-II显微镜图像（h）。i-j）注射IR-783@DIII-Tate（i）的AR42J荷瘤小鼠的NIR-II图像以及靶向和非靶向复合体在12h的生物分布（j）。k）注射IR-783@DIII-PSMA-617的PC3和PC3-PIP荷瘤小鼠的NIR-II显微镜图像。

首先研究用DⅢ会如何改变花菁类染料在体内行为。如图4a、b所示，当给小鼠注射游离IR-783时，该染料立即在肝脏中积累，之后染料重新分布到脾和肠道，属于肝胆清除。相比之下，IR-783@DIII立即在肾脏中积累，然后迅速重新分布到膀胱，属于肾脏清除。接着比较注射IR-780@DIII（含氯染料）和ICG@DIII（无氯染料），发现只有含氯的染料才会改变体内药代动力学性质（图4C）。所以，DIII可以作为含氯花菁类染料的保护性共价涂层，为超亮NIR-II成像提供量身定制的药代动力学。

接着用生物功能小分子修饰DⅢ，如图4d所示，用TATE和PSMA-617分别修饰在DⅢ上，虽然荧光强度比起没修饰前下降，但是要强于游离染料。在细胞成像中用生物功能小分子修饰过的染料具有良好的靶向能力（图4g、h）。同样在荷瘤小鼠中也具有良好的靶向性，在注射后3小时内在肿瘤内积聚，并随着时间的推移而增加（图4i-k）。

图5.与染料@DIII相比，染料@DIIIa显示出更好的药代动力学和可编辑特性

a）用重组毕赤酵母表达DIIIa。b）DIIIa和DIIIb的电泳结果。c）IR-783、ICG和IR-780与DIII、DIIIa或DIIIb结合的NIR-II图像。d、e）侧位（d）和仰卧位（e）注射IR-783@DIIIa的健康小鼠的NIRII图像。f）IR783@DIIIa-TATE的示意图。g、h）注射IR-783@DIIIa-TATE的AR42J荷瘤小鼠的NIR-II图像（g）和肿瘤与肌肉的比率（h）。

首先在毕赤酵母中表达出DIIIa和DIIIb（图5a）。如图5c所示，IR-783@DIIIa的亮度与IR-783@DIII相当，ICG和IR-780也是表现出相同结果。所以DⅢ结构域中与花菁类染料结合的亚基是DIIIa。由于DIIIa是DIII的片段，它的分子量大约是DIII的一半，因此推测IR-783@DIIIa的肾脏排泄率将高于IR-783@DIII。于是在健康小鼠体内注射IR-783@DIIIa，用于评估它的药代动力学特性，发现在膀胱中它的积累速度比起IR-783@DIII更快，所以DIIIa可以提供小分子样的药代动力学特性并且不损害荧光亮度。接着在荷瘤小鼠注射，发现与IR-783@DIIIa相比，IR-783@DIIIa-TATE在肿瘤部位的蓄积显著增加(图5g、h)。

图6.Dye@TDIII表现出白蛋白样药动学和2.7倍的亮度增强

a）用重组毕赤酵母表达TDIII。b）TDIII1（linker：Leu-Glu）和TDIII2（linker：-[Gly-Gly-Gly-Gly-Ser]2-）的电泳结果。c）随着染料与蛋白摩尔比从0.25：1增加到16：1，染料与白蛋白、DIII、TDIII的混合物荧光强度的变化趋势。d）比较IR783@TDIII和IR-783@HSA的半衰期。e、f）注射IR-783@TDIII的剃毛小鼠颅骨下血管的高倍率（2.5倍）NIR-II图像（e）和ROI分析（f）。g-i）注射IR-783@TDIII的先天性淋巴水肿小鼠的高倍率（2.5倍）NIR-I和NIR-II图像（g）、横截面强度分布（h）和ROI分析（i）。j）PC3肿瘤的高倍率（2.5倍）NIR-II图像。

长循环探针适用于淋巴和血管成像，但是染料@DⅢ/DIIIa通过肾脏迅速被清除，不能起到长循环探针的作用。IR-783@白蛋白是一种长循环探针，循环时间为19天，与内源性蛋白相当。假设将三个结构域替换为DⅢ结构域，也将保留内源性蛋白的一些性质。于是在毕赤酵母中表达TDIII（图6a），并且用电泳鉴定(图6b)。接着进行光度滴定实验，如图3c所示，来评估TDIII的载染料能力，发现只有染料与TDⅢ的摩尔比为3：1时荧光强度最大，并且当摩尔比为0.5：1、0.75：1和1：1时，荧光强度与DIII相当，所以结果表明TDIII的染料载量约为DIII的3倍，但较高的染料载量也会导致自猝灭。

接下来研究TDIII在高分辨率血管、淋巴成像和先天性淋巴水肿检测中的应用。对比注射IR-783@TDIII和IR-783@HSA的健康小鼠，发现它们在体内的半衰期类似，说明IR-783@TDIII也是长循环探针。接着IR783@TDIII对血管进行了实时近红外成像，发现可以对浅层皮下血管成像。于是尝试勾勒出深层血管，如图6e、f所示，对头骨和皮肤下的血管实现高分辨率成像。最后探索对淋巴结和淋巴管成像，如图6g、h所示，监测一只患有先天性淋巴水肿的小鼠，清晰看到弯曲的淋巴管和水肿的淋巴结。同时，还可以使用高倍率NIR-II成像来描绘PC3肿瘤血管(图6j)。

图7.Dye@TDIII促进高质量的成像引导手术

a-c）IR-783@HSA和IR-783@TDIII在连续激光照射下的光稳定性。d）动物影像引导手术导航平台。e、f）在有无室内照明条件下，瘤内注射IR-783@TDIII的小鼠转移瘤旁淋巴结切除前后的NIR-II图像。g-j）通过腋窝淋巴结转移的原位乳腺癌小鼠的生物发光和NIR-II图像。生物发光成像用于监测肿瘤的进展和前哨淋巴结的转移。黄色箭头表示转移性淋巴结。

目前，临床上使用的花菁类染料具有快速光漂白和清除的缺点，探索IR-783@TDIII是否可以解决这些问题。首先，如图7a-c所示，与IR-783@HSA相比，IR-783@TDIII具有更高的光稳定性。接着，如图7d-f所示，将IR-783@TDIII注射到4T1荷瘤小鼠体内，确定前哨淋巴结的位置。在明亮的光照和激光照射下进行成像引导手术，发现前哨淋巴结可以被精确定位和切除。接下来，研究IR-783@TDIII在原位4T1乳腺癌模型中的成像性能，如图7g-j所示，使用IR-783@TDIII可以在明亮的房间照明下捕获转移的淋巴结的高质量荧光图像。

总结：开发了一种简单的策略来设计明亮和可编辑的NIR-II荧光团，使它具有定制的药代动力学性质。通过用蛋白质外壳包裹中心发射团花菁类染料，来获得更高的荧光亮度和良好的药代动力学性质。并且，还可以通过修饰蛋白质外壳（与生物小分子结合、改变蛋白质外壳大小），来获得需要的清除途径和药代动力学性质。

参考文献

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