本文要点： 生物组织的光散射限制了活体动物体内高分辨率光学显微镜成像的穿透深度。减少光散射和增加成像深度的一种有效方法是将激发和发射波长扩展超过1000nm的第二个近红外窗口(NIR-II)。作者开发了具有生物相容性的核壳结构PbS/CdS量子点，发射于1880nm，以及超导纳米线单光子探测器SNSPD用于超过1700nm信号的检测，使单光子激发荧光成像窗口位于1700-2000nm(NIR-IIc)范围——这是迄今为止最长的单光子激发和发射。通过完整的小鼠头部的NIR-IIc共聚焦荧光成像深度达到1100μm，并能够在没有进行任何手术的小鼠腹股沟淋巴结中进行无创的细胞分辨成像，实现了直径小至6.6μm的高内皮小静脉、CD169+巨噬细胞和CD3+T细胞的体内分子成像。
背景：限制光学成像进入深层生物组织的因素之一是吸水率；由于O-H键弯曲的振动泛音模式，水在1,445nm处出现了一个局部吸收峰。在800-1400nm范围内，光吸收相对较低，大脑等组织的成像受散射影响为主，可以在厘米深度成像，但由于光散射，分辨率会损失。水的吸光度和光散射都会影响NIR-IIb窗口(1500-1700nm)的成像。在1700nm以上，光散射进一步减少，但对水的吸光度增加。到目前为止，还没有关于波长大于1700nm的单光子激发荧光成像生命系统的报道，由于缺乏具有足够的量子产量/亮度的生物相容性荧光探针，而且InGaAs相机对NIR-IIc/NIR-IId范围内波长大于1700nm的光不敏感。
实验内容：作者合成了发射峰在2009nm的硫化铅量子点。然后通过阳离子交换方法在硫化铅核上生长一个硫化镉壳，以保护硫化铅核不被降解。这使核心的发射峰位移到1880nm。为了将QDc从有机相转移到水相，作者将亲水聚合物交联网络(P3涂层)涂层在QDc上，使其在生理环境中具有生物相容性，通过胆道排泄，没有明显的毒性。最终P3-QDc在NIR-IIc中的峰值发射波长为1820nm。可检测1550~2000nm波长的探测器SNSPD也克服了InGaAs探测器1700nm的检测限制。
作者首先成像充满水悬浮液的50-μm直径毛细管，使用发射峰值在NIR-IIb的P3-QDb或NIR-IIc的P3-QDc，浸在5%脂质溶液内，模拟小鼠脑组织的血管。SNSPD的SBR，分辨率比InGaAs相机高，NIR-IIc的波长下, SNSPD可以实现更深深度的成像，1650nm激发下，可在4.4mm下分辨毛细管，比1540nm激发NIR-IIc成像和1319nm激发NIR-IIb成像更深。（图2a-c）1900nm以上的荧光信号随着水层的增加而减少，说明水对荧光吸收的影响。（图2d）
图2
作者通过完整的小鼠头部进行了血管的NIR-IIc无创三维共聚焦成像，解决了三维的老鼠头部层成像(图3b)。观察到通过脑膜连接颅骨和大脑皮质的血管状通道。这些通道被证明对大脑对损伤和感染的免疫反应是重要的。作者比较了SNSPD与商业光电倍增管(PMT)，相对于PMT，SNSPD的SBR和成像深度都更高。对于1319nm激光激发下的NIR-IIb成像，基于SNSPD的共聚焦显微镜分辨了PMT未检测到的小毛细血管，并在更大的成像深度下允许更高的空间分辨率(图3c，第一柱和第二柱；图3d)。在1540nm的激光激发下，使用SNSPD在NIR-IIc窗口的成像比在1319nm的NIR-IIb区域分辨率更好。比较1650nm和1540nm激光进行NIR-IIc成像；1650nm激发下FWHM量化的空间分辨率明显提高(图3c，第三柱和第四柱；图3d，e)。只有1650nm激光激发的NIR-IIc成像允许在超过1,100μm的深度成像小鼠头部，而且对比度最高（图3d,e）。
图3
作者通过完整的小鼠皮肤对淋巴结进行了成像，这与以前通过侵入性手术安装透明窗口的活体显微镜检查法不同。首先对小鼠腹股沟淋巴结中HEV上的PNAd进行无创体内NIR-IIc分子成像。将结合了P3-QDc的抗MECA-79抗体(aMECA-79-QDc)注射到小鼠体内，24小时后注射有机探针p-FE（NIR-IIb区成像血管）。在NIR-IIb和NIR-IIc中进行InGaAs宽视场成像和SNSPD共聚焦显微镜成像，观察到aMECA-79-QDc的发射以及标记的血管(图4b,c)，明显看到SNSPD的背景信号更低。而注射没有无偶联aMECA-79的P3-QDc的对照组小鼠的淋巴结中未检测到QDc发射信号。高分辨率三维共聚焦成像中，只有HEV被aMECA-79-QDc标记，说明了aMECA-79-QDc的靶向性(图4d)。P3-QDc和aMECA-79-QDc的稳定性允许在4天内对淋巴结中HEV成像(图4e)。
图4a-e
为了实现细胞分辨率的体内无创NIR-IIc共聚焦显微镜成像，对完整小鼠淋巴结中的CD169（巨噬细胞表达）和CD3（T细胞表达）进行双色分子成像。作者将CD169抗体结合到QDs(aCD169-QDa)，CD3抗体结合到P3-QDc(aCD3-QDc)。注射后1天，宽视场图像显示淋巴结中存在较强的aCD169-QDa和aCD3-QDc信号(图4f)。双色大面积共聚焦显微镜显示，被aCD169-QDa标记的CD169+巨噬细胞勾画出包膜下窦；由aCD3-QDc标记的CD3+T细胞位于淋巴结内部的T细胞区(图4g，h)。未标记的B细胞滤泡也可以被识别出来(图4h中的黑暗区域)，因为它们靠近巨噬细胞层，并被T细胞包围。500μm深度下仍可以看到CD3+T细胞在1,650nm激发下标记在细胞的外部(图4i)。在体外，用DRAQ7染料对细胞核进行染色。DRAQ7和aCD3-QDc在体外共聚焦下可清晰分辨细胞被aCD3-QDc勾画出来(图4j)。这些结果建立了体内完整淋巴结下细胞分辨的无创NIR-IIc共聚焦显微镜成像。
图4f-j
总结：作者开发了发射峰超过1700nm（NIR-IIc）的量子点探针和可探测1700nm以上信号的探测器SNSPD，增加了近红外成像的穿透深度，可通过完整的小鼠头部成像脑膜下的脑血管，可分辨淋巴结内的T细胞和吞噬细胞。
参考文献
https://doi.org/10.1038/s41565-022-01130-3
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