本文要点：胰腺癌是最具侵袭性和致命性的恶性肿瘤之一，然而常规光疗材料具有穿透深度较低、对氧的依赖性强、对热休克蛋白抑制作用高的缺点，制约了整体治疗效果。在这项研究中，作者设计了一种具有聚集诱导发射(AIE)特征的光敏剂DCTBT，该光敏剂具有近红外二区荧光成像(NIR-II FLI)、I型光动力疗法(type-I PDT)和光热疗法(PTT)的功能。在EGFR靶向多肽修饰的两亲性聚合物的辅助下，制备的DCTBT脂质体能够有效地在胰腺肿瘤部位蓄积和可视化，并显著抑制PANC-1皮下和原位肿瘤模型的肿瘤生长。
方案1. 分子设计示意图及其在NIR-II-FLI引导的I型PDT-PTT协同胰腺癌治疗中的应用
首先对分子进行设计，DCTBT是在CTBT的基础上在咔唑中引入二苯胺片段。二苯胺片段可以促进分子内较强的D-A相互作用，实现较低的带隙和吸收、发射波长的红移。另外，较强的D-A相互作用可以进一步分离HOMO和LUMO之间的分布，获得较小的单重态-三重态能隙，促进I型ROS的产生。此外，二苯胺片段可以作为自由旋转的分子旋转体，消耗激发态能量，显著降低分子间的π-π相互作用，提高DCTBT的AIE表征。
图1. A)CTBT和DCTBT在CHCl3中的归一化吸收光谱 B)DCTBT在不同含水率(fw)的THF/水混合物中的荧光光谱 C)相对发射强度(I/I0)与含水率的关系图，I0和I分别是这两个分子在THF和THF/水混合物中的荧光强度峰值 D)CTBT和DCTBT的粒度分布 E)CTBT和DCTBT的透射电子显微镜图像 F)CTBT（左侧）和DCTBT（右侧）在水溶液中的归一化吸收光谱 G)两种NPs在水溶液中的归一化发射光谱 H)两种NPs和ICG的光稳定性 I)两种NPs和IR-26(QY=0.5% 在二氯乙烷中)在五种不同浓度下的积分荧光光谱(900-1500nm)的曲线图
接着进一步探索CTBT和DCTBT在聚集态的荧光性质。如图1B-1C所示，水含量从0%到90%，CTBT荧光强度都是低于溶液状态的荧光强度。而水含量为90%的DCTBT的荧光强度比溶液状态提高了5.9倍，表明DCBTB具有AIE特征。推测是由于DCBTB中二苯胺片段使DCBTB具有丰富的分子旋转和较大的扭曲构型，抑制了有害的分子间相互作用。为了验证这样推测，估算这两个NPs的扭曲分子内电荷转移(TICT)性质，结果表明DCTBT具有高度的激发态和更强的TICT性质，验证了上述推测。
为了在形态水平上进一步解释CTBT和DCTBT的光物理性质，以两亲共聚物DSPE-PEG2000为包覆基质，将CTBT和DCTBT组装成纳米粒子。制备的NPs具有良好的水分散性，呈球形，直径分别为67nm和100nm左右（图1D-1E），具有良好的的光稳定性（图1H），DCTBT NPs具有近红外二区发射（1F-1G），以IR-26(QY=0.5%)为参照，CTBT NPs和DCTBT NPs水溶液的量子产率分别为16.92%和4.37%（图1I）。这两个NPs具有NIR-II发射特性和高荧光效率，是生物应用的理想候选者。
图2. 在CTBT或DCTBT NPs存在下A)DCFH(整体ROS检测)、B)DHR123(O2·-检测)和C)HPF(·OH检测)在不同时间激光照射下的荧光强度的相对变化D)在CTBT或DCTBT NPs存在下，ABDA(1O2检测)在不同时间激光照射下的分解率E)相同摩尔浓度的CTBT和DCTBTNPs在808nm（0.8W cm-2）激光照射5min冷却至室温下的光热曲线 F）DCTBTNPs在808nm（0.8W cm-2）激光照射6min的光热性能与浓度的关系
接下来先用DCFH-DA来评价总的ROS产生（图2A）,接着用不同探针检测ROS的种类，先用DHR123和HPF来检测是否通过I类路径产生·OH和O2·-（图2B-2C），接着用ABDA来检测是否通过II类路径产生的1O2（图2D），这些结果表明两个NPs都具有产生ROS的能力，但是II路径产生的ROS被抑制，可以通过I路径产生·OH和O2·- 。
进一步评价两个NPs的光热性能。如图2E所示，CTBT NPs和DCTBT NPs水分散体的最高温度分别达到55.7℃和62.8℃，结合光热转换率，得到DCTBT NPs比CTBT NPs具有更优异的光热转化性能的结论，推断可能是DCTBT中二苯胺使DCTBT的构象更加扭曲，导致更有效的非辐射衰减过程。DCTBT NPs表现出浓度依赖的温度升高（图2F），验证了上述推测。
图3. A)用DCFH、DHE、AFP和SOSG分别作为总ROS、O2·-、·OH和1O2荧光指示剂检测PANC-1细胞中的ROS，比例尺：100μm B)不同浓度的lip-DCTBT NPs与PANC-1细胞孵育后，在无或者有激光（808nm，0.8W cm-2）照射下的细胞活力 C）经lip-DCTBT NPs处理后的PANC-1细胞的活/死细胞染色。绿色和红色分别代表活细胞和死亡细胞，比例尺：200μm
接着以卵磷脂、胆固醇和DSPE-mPEG2000为包封剂，制备疏水性DCTBT脂质体（Non-Target-NPs），再用DSPE-PEG2000-GE11修饰脂质体表面制备具有癌细胞靶向性的NPs（Target-NPs）。lip-DCTBT NPs具有较高的水溶性，呈球形，平均粒径为80nm（Cryo-TEM）和121nm（DLS）。Target-NPs和Non-Target-NPsZETA电位分别为-20.3mV和-24.3mV。
进一步研究lip-DCTBT NPs在PANC-1癌细胞中的细胞内ROS产生。如图3A所示，有lip-DCTBTNPs加激光照射后，DCFH-DA、DHE和APF三种探针都呈现出明亮的绿色或红色荧光，而对照组几乎没有观察到明显的荧光信号，值得注意的是，Target-NPs的荧光强度远高于Non-Target-NPs，这表明lip-DCTBT NPs能有效地在PANC-1癌细胞中通过I类途径产生O2·-和·OH，而且肿瘤靶向配体可以促进NPs在癌细胞中的转运和积聚。
用CCK-8比色法评价对PANC-1癌细胞的体外协同光治疗的效果。如图3B所示，表明Target-NPs和Non-Target-NPs对PANC-1癌细胞的毒性作用具有剂量依赖性。接着用活/死细胞染色实验进一步验证这两种NPs对PANC-1癌细胞的治疗效果，如图3C所示，表明，lip-DCTBT NPs对PANC-1癌细胞有毒性作用，其中Target-NPs光疗效果比Non-Target-NPs好。两个实验结果一致，证明了Target-NPs对PANC-1癌细胞具有良好的光消融能力。
图4. A)静脉注射lip-DCTBTNPs后不同监测时间的PANC-1荷瘤小鼠皮下NIR-II荧光图像，a：Non-Target-NPs，b：Target-NPs B)热成像，注射lip-DCTBT NPs后8小时，荷瘤小鼠在连续808 nm激光照射下（肿瘤部位）的加热温度 C)各治疗组的相对肿瘤体积变化，**P < 0.01, ***P <0.001 D)不同治疗后第17天采集的肿瘤图像，比例尺：1cmE)第17天记录各组平均瘤重，**P<0.01 F)不同治疗方法肿瘤组织的H&E、Ki67和TUNEL染色分析，比例尺：200μm
紧接基于良好的体外光疗性能，作者对PANC-1肿瘤进行了体内评估。在体内对lip-DCTBT NPs进行NIR-II FLI，如图4A所示，lip-DCTBT NPs在注射48h后肿瘤部位的荧光信号仍然很强，并且Target-NPs组比起Non-Target-NPs组在肿瘤部位呈现出更明亮的荧光成像，这表明lip-DCTBTNPs在肿瘤部位中具有长期NIR-II荧光示踪的潜力，引入的EGFR配体使lip-DCTBT NPs的肿瘤靶向能力增强。
为了进一步验证lip-DCTBT NPs的光热治疗潜力，在皮下PANC-1肿瘤小鼠上进行了体内光热评估。如图4B所示，Target-NPs处理的小鼠肿瘤区域的温度在1min内从32.9℃迅速上升到59.6℃，在5分钟内达到63℃左右的平台值，并且表现出更高的温度升高，这显示出lip-DCTBT NPs在PTT应用的巨大潜力。
在皮下肿瘤模型上评价lip-DCTBT NPs的光疗效果，将PANC-1荷瘤BALB/c裸鼠随机分为5组（PBS；PBS+laser；Target-NPs；Non-Target-NPs+laser；Target-NPs+laser）。如图4C所示，对照组(PBS；PBS+laser；Target-NPs)的肿瘤体积持续增大，相比之下，实验组（Non-Target-NPs+laser；Target-NPs+laser）的肿瘤生长得到明显抑制，并且Target-NPs+laser的抑瘤率（87.5%）明显高于Non-Target-NPs+laser（72.7%）（图4D-4E），实验结果表明NPs加上激光照射才具有杀瘤效果，靶向性的NPs具有更好的杀瘤能力。为了进一步探讨不同治疗方法的抗肿瘤效果，采用组织学和免疫组织化学方法（包括H&E染色、Ki67检测和TUNEL检测），对肿瘤活检组织进行分析。结果表明Target-NPs+laser处理的肿瘤组织比起其他组，显示出严重的损伤和大量空泡化，表现出最低的增殖和最高的凋亡水平（图4F）。
图5. A)原位PANC-1肿瘤模型体内光疗的时间表B)在治疗过程中不同时间点记录的不同组小鼠的生物发光图像 C)在第16天记录各组的平均瘤重，**P<0.01 D)治疗后第16天切除脾的肿瘤图像，比例尺：1cm E)不同治疗方法肿瘤组织的H&E、Ki67和TUNEL染色分析，比例尺：200μm
最后研究lip-DCTBT NPs用于胰腺原位肿瘤模型的光疗效果。将荷瘤小鼠随机分为5组（PBS；PBS+laser；Target-NPs；Non-Target-NPs+laser；Target-NPs+laser）。如图5B所示，对照组(PBS；PBS+laser；Target-NPs；)肿瘤的荧光信号逐渐增强，相反，实验组（Non-Target-NPs+laser；Target-NPs+laser）的小鼠在肿瘤部位出现了较弱的荧光强度。五组依次的平均肿瘤解剖重量为0.54、0.57、0.53、0.16和0.04g（5C-5D），这些实验结果表明lip-DCTBT NPs+laser才具有良好的肿瘤生长抑制作用，靶向性的NPs具有更好的杀瘤能力。之后用H&E染色、Ki67和TUNEL法检测肿瘤细胞的增殖活性(图5E)，验证了上述的结论。
结论：作者成功开发了一种AIE活性的光热敏剂，它同时具有NIR-II FLI、type-I PDT和PTT功能。通过在CTBT主链上合理地引入二苯胺片段，得到具有更好AIE性质和吸收、发射波长红移的DCTBT分子。为了最大限度地提高光疗效果，进一步将EGFR靶向多肽修饰的两亲性聚合物DSPE-PEG2000-GE11作为包裹基质，来促进lip-DCTBT NPs在肿瘤部位的积累。体外和体内实验表明，Target-NPs在NIR-II FLI引导的I型PDT-PTT协同治疗下，对PANC-1皮下和原位肿瘤模型的肿瘤生长有明显的抑制作用。这些研究发现为探索先进的胰腺癌光疗材料开辟新的视角，并刺激临床试验的最新发展。
参考文献
D. Li et al."Synchronously boosting type-I photodynamic and photothermal efficacies via molecular manipulation for pancreatic cancer theranostics in the NIR-II window."Biomaterials.283 (2022) 121476.
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