本文要点：基于小分子的第二近红外 (NIR-II) 可激活荧光探针可以潜在地提供高目标背景比和深层组织穿透。然而，由于缺乏通用且稳定的光学可调基团，大多数报道的 NIR-II 可激活小分子探针的通用性较差。在这项研究中，作者设计了 NIRII-HD，一种针对 NIR-II 探针开发进行优化的新型染料支架。特别是，染料 NIRII-HD5 表现出最佳的光学特性，如适当的 pKa 值、出色的稳定性和高 NIR-II亮度，这有利于高对比度的体内成像。为了证明 NIRII-HD5 染料的适用性，设计了三种用于 ROS、硫醇和酶的靶向激活 NIR-II探针。使用这些新型探针，不仅在小鼠模型中实现了不同疾病的可靠 NIR-II 成像，而且还以高保真度评估了体内肝损伤期间肝组织的氧化还原电位。
图 1. a) 报告的已激活探针平台 b) 新型活化探针平台NIRII-HD染料的合理设计
图 2. a) O-HD 和 NIRII-HD1 在 PBS 缓冲液中的归一化吸收和发射光谱; b)50μM HClO 和 c) 5μM ONOO-的时间依赖性吸收光谱；d) 50μM HClO 和 e) 5μM ONOO- 的时间依赖性吸收光谱; f)NIRII-HD3 和g) NIRII-HD5 的归一化吸光度与 λmax 处 pH 的对应图；h) ICG/O-HD (5μM) 和 NIRII-HD 染料（1-5 分别代表 NIRII-HD1-5）在 PBS（pH 7.4，含有 30% EtOH 和 1% 吐温）中的相对吸收 i) PBS 缓冲液中染料溶液的归一化吸收
首先为了设计具有与 O-HD 相似性质的 HD 类 NIR-II 染料需要：（1）增强 O-HD 的吲哚杂环部分的供体强度以延长其发射， (2) 在 O-HD 的破坏位点引入封端基团以增加其稳定性；(3) 降低 O-HD 或其类似物酚基的 pKa 值以增强其相应分子探针的响应性能在生理环境中。基于这些考虑，合成了新型 HD-like NIR-II 染料 NIRII-HD1-5，并且评估了表现最佳的染料NIRII-HD5 用于体内成像的潜力。MTT 测定并证明 NIRII-HD5 对细胞活力没有显着影响，然后，在体内评估 NIRII-HD5 的细胞毒性，实验组小鼠未出现任何器官损伤。
图 3. a) 淋巴结成像示意图 b) O-HD及其类似物（标记为1、2和3）和NIRII-HD5（标记为4）的结构式 c) O-HD 及其类似物与 NIRII-HD5 在 NIR-I 或 NIR-II 荧光成像窗口对腘窝淋巴结的比较;使用 d) NIRII-HD5 和具有 (+)/不具有 (-) 激光照射和夹子阻断的 ICG 在注射后的不同时间点拍摄的腘窝淋巴结的荧光图像 e) 用 (+)/不用 (-) 激光照射的腘窝淋巴结的荧光强度信号与从图 3d 获得的时间作图
其次，探索了 NIRII-HD5 在活体深部组织成像方面的能力，并将成像性能与 O-HD 的成像性能进行了比较。从活体成像中可以看到，混合溶液皮内注射后，NIRII-HD5在NIR-II窗口（1000-1700 nm）有清晰的淋巴结成像，其SBR高达10.5 （图 3a-3c）。相比之下，O-HD 及其两种类似物在发射通道（695-770nm，NIR-I 区域）中显示出弱荧光以及较差的信背比（SBR < 2.4）（图 3c）。这些结果表明，O-HDs在活体小鼠淋巴结中的不良成像性能主要是由于NIR-I光的组织穿透力较弱和组织背景自发荧光较强，进一步证明了NIRIIHD5优越的深部组织成像能力。
如图3d和3e所示，860 nm激光照射5分钟后，NIRII-HD5仍能清晰区分淋巴结，NIRII-HD5的荧光强度保持不变。相比之下，ICG 在相同通量率下用 808 nm 激光激发 5 分钟后大部分褪色，仅保留初始发射强度的 30%。结果表明 NIRII-HD5 具有优异的光稳定性，这将有利于长时间的体内成像。此外，值得注意的是，腘窝淋巴结的ICG信号在照射后5分钟即可恢复，说明小鼠的淋巴管未受损，因此富集在小鼠足底的ICG染料可以流到小鼠足底。淋巴结再次通过淋巴管（图3d-3e）。为了进一步证实这一点，增加了一个实验，在激光照射后用止血夹阻塞淋巴管。结果显示，与未使用止血夹的对照组相比，ICG淋巴结信号的恢复明显受到抑制（图3d-3e）。
图 4. a) 分别用于 ONOO-、GSH 和 ALP 检测的三个探针的设计 b) NIRII-HD5-ONOO-(5μM), e) NIRIIHD5-GSH (5μM), h) NIRII-HD5-ALP (5μM) 分别响应生物标志物的归一化吸收光谱 c）NIRII-HD5-ONOO-（5μM）响应ONOO（0-10μM）的荧光光谱 d) NIRII-HD5-ONOO- (5μM) 对各种分析物的荧光响应 f)NIRII-HD5-GSH (5μM) 响应 GSH (50–1400μM) 的荧光光谱 g) NIRII-HD5-GSH (5μM) 对各种分析物的荧光响应
接着，如图 4a 所示，基于 NIRII-HD5，开发了三种可激活的 NIR-II荧光探针 NIRII-HD5-GSH、NIRII-HD5-ONOO-和 NIRII-HD5ALP，用于检测 GSH、ONOO-和 ALP 活性，选择这三个成像目标是因为它们代表三种不同类型的分析物（ROS、硫醇和酶），同时在各种生物过程中也很重要。选择性实验表明，NIRII-HD5-ONOO-对ONOO-表现出比其他生物物种高的选择性（图4d），表明它可以用作ONOO-检测的有效荧光探针。同样，探针 NIRIIHD5-GSH 也可以在 PBS 缓冲液中被 GSH 有效激活。如图 4e-4g 所示，在 1.4 mM GSH 存在下，NIRII-HD5-GSH 在 895 nm 的峰值处表现出显着的荧光增强，而在添加其他生物物种后观察到的变化可忽略不计。最后，确定 NIRII-HD5-ALP 保留了其对 ALP 的响应性。与探针 NIRII-HD5-ONOO- 和 NIRII-HD5GSH 类似，探针 NIRII-HD5-ALP 也显示出 ALP 依赖性响应和优异的选择性（图 4h ）。总的来说，结果表明，与原始染料 O-HD 相似，新型染料 NIRII-HD5 可用作设计用于 NIR-II 传感的可激活荧光探针的有效平台。
图 5. a) 使用 NIRII-HD5-ONOO- 探针（1：腘窝淋巴结；2：坐骨淋巴结）对 LPS 诱导的淋巴炎症进行示意图和 NIR-II荧光成像 b）随时间推移，从 LPS 处理/盐水处理组获得的腘（红圈）和坐骨神经（蓝圈）淋巴结的荧光信号 c) 转移性肿瘤诱导的前哨淋巴结的体内成像 NIRII-HD5-GSH探针4T1淋巴结转移模型建立及肿瘤侧及正常侧淋巴结荧光成像示意图。d) 图 5c 中随时间从肿瘤侧/正常侧获得的腘窝和坐骨淋巴结的荧光信号 e）正常侧和肿瘤侧淋巴结切片中CD206的免疫组织化学图像
紧接着为了证明NIRII-HD5 衍生探针用于体内荧光检测的能力，NIRII-HD5-ONOO- 首次应用于检测脂多糖 (LPS) 皮内注射诱导的淋巴炎症小鼠模型中的 ONOO-。如图5a所示，与生理盐水处理的对照组相比，LPS诱导的实验组腘窝和坐骨淋巴结在NIRII-HD5-ONOO-给药后均表现出明显的亮度。特别是，与对照组相比，LPS 组中腘窝淋巴结的信号在注射探针后 30 分钟后增加了2 倍（图 5b）。该结果表明LPS确实可以诱导淋巴结炎症，探针NIRII-HD5-ONOO-可用于对该过程进行成像。
为了进一步可视化和跟踪淋巴实体瘤转移，通过GSH特异性反应探针检测到淋巴管中GSH的波动。因此如图 5c 所示，当将 NIRII-HD5-GSH 注射到 4T1 荷瘤小鼠的左右后爪中时，在腘窝和坐骨淋巴结中观察到了耀眼的 NIR-II 荧光。肿瘤侧（右侧），而小鼠正常侧（左侧）的淋巴结表现出弱荧光。相比之下，在正常小鼠（无荷瘤小鼠）两侧的淋巴结中检测到几乎相同的微弱荧光信号。量化平均强度显示，肿瘤侧腘窝和坐骨淋巴结区域的信号比正常侧高出3倍，表明确实发生了癌细胞通过淋巴管的代谢迁移（图5d）。这些结果证实，源自NIRII-HD5 的新型 NIR-II 探针可用作体内疾病诊断的有效工具。
图 6. a) APAP 诱导的肝损伤和 N-乙酰半胱氨酸 (NAC) 治疗的示意图 b) 分别通过探针 NIRII-HD5-GSH 和探针 NIRIIHD5-ONOO- 用盐水、APAP 和 APAP+NAC 处理的小鼠肝脏的 NIR-II 图像， SBR 从图 6b 中的 c) NIRII-HD5-GSH 和 d) NIRII-HD5-ONOO- 获得 e) 用盐水、APAP 和 APAP+NAC 处理的小鼠肝脏的代表性组织学
APAP 在肝脏中进行酶促生物转化产生 N-乙酰基-对苯醌亚胺 (NAPQI)，该亚胺可被谷胱甘肽 (GSH) 迅速还原。APAP过量后，过量产生的NAPQI会消耗GSH，导致细胞蛋白直接结合，导致线粒体功能受到干扰，释放出大量ROS（如ONOO-），此外，N-乙酰半胱氨酸 (NAC) 作为一种保肝药物，可产生 GSH 来抵消 APAP 引起的肝脏氧化应激（图 6a）。最后检查了 NIRII-HD5 探针（NIRII-HD5-GSH 和 NIRII-HD5-ONOO-）是否可以监测这一过程体内具有 NIR-II 成像。如图 6b 和 6c 所示，用盐水处理的正常 Balb/c 小鼠在施用 NIRII-HD5-GSH 后在肝脏中显示出高荧光。在用 300 mg kg-1 APAP 预处理 12 小时后，在小鼠肝脏中观察到 NIR-II荧光显着降低。相比之下，探针NIRII-HD5-ONOO- 在药物刺激前后小鼠肝脏中表现出相反的荧光变化（图 6b 和 6d）。这些结果表明，随着药物性肝毒性的发生，小鼠肝脏中的GSH被消耗，肝脏组织中的ROS（ONOO-）显着增加。小鼠先用 300 mgkg-1 APAP 预处理诱导肝损伤，然后用 NAC (600 mg kg-1) 治疗，与仅接受 APAP (300 mg kg-1) 的小鼠相比，NIRIIHD5-的荧光显着增强观察到 GSH 和 NIRII-HD5-ONOO- 明显减少。
参考文献
Angew Chem Int Ed Engl. 2022 Feb 25:e202201541. doi:10.1002/anie.202201541. Epub ahead of print. PMID: 35218130.
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