本文要点：苯并噻二唑核发色团具有良好的稳定性、较大的斯托克偏移和易于扩展发射到NIR-II范围等优点。然而，在充分发挥其生物应用潜力之前，还需要克服水溶性差、水溶液中的聚集致猝灭ACQ和非活化反应等障碍，这些荧光团通常是惰性探针，发出不变的或“一直开着”的信号，构成附加的背景噪音，不能对特定刺激做出反应，无法实现生物标志物激活的检测或成像。在本研究中，作者设计了一种可激活的苯并噻二唑核纳米探针BTPE-NO2@F127,此探针具有AIE特性，通过整合生物标记物响应部分和采用封装分子探针的自组装设计策略克服上述障碍，该纳米探针用于体内NIR-II荧光成像和MSOT成像能够原位响应曲唑酮诱导的肝损伤，肝缺血再灌注损伤（I/R）和间质性膀胱炎小鼠模型中的H2O2生物标志物进而进行检测和成像，此外，获得的三维MSOT图像有利于三维信息的疾病部位可视化。

纳米探针BTPE-NO2@F127的合成策略如图1所示，将苯并噻二唑核与两个四苯基作为疏水分子转子连接，然后在核两端加入两个硝基苯氧乙酰胺单元作为识别基团和荧光猝灭剂。然后使用经FDA批准的两亲性聚合物Pluronic F127来封装BTPE-NO2分子，以生成纳米探针BTPE-NO2@F127。

图1：纳米探针BTPE-NO2@F127的制备及其应用（间质性膀胱炎、曲唑酮诱导的肝损伤和小鼠肝脏I/R损伤）示意图。

随后，作者对合成的纳米探针进行表征如图2所示，为了验证BTPE-NH2的AIE特性，测量了其在二甲基亚砜(DMSO)/水(好溶剂:DMSO，差溶剂:水)的混合物中随水馏分变化的荧光强度。改变水馏分可以微调溶剂混合物的溶解能力，相应地调整BTPE - NH2的聚集程度。如图2a、b所示，随着水馏分的增加，BTPE- NH2溶液的发射强度明显增加，表现出典型的AIE特征。当水含量达到99%时，BTPE-NH2的荧光强度比DMSO溶液增强12.8倍。由于探针BTPE-NO2具有较强的疏水性和较高的共轭性，经Pluronic F127封装后可获得较高的封装效率(98%)，BTPE-NO2在纳米探针BTPE-NO2@F127中的负载能力为9.3%。透射电子显微镜(TEM)显示纳米探针BTPE-NO2@F127具有相对均匀的球形形貌，直径约为37 nm(图2c)，动态光散射(DLS)测量的纳米探针BTPE-NO2@F127的粒径分布如图2c所示。在37℃下在PBS (10 mM, pH=7.4)中测量不同浓度的H2O2处理BTPE-NO2@F127后的光谱(图2d-g)。1028 nm处的荧光强度随着H2O2浓度的增加而增加(图2d-g)，而纳米探针BTPE-NO2@F127在没有H2O2的情况下发射微弱。纳米探针BTPENO2@F127在H2O2孵育前后的吸收光谱如图2f所示。在对H2O2反应之前，该纳米探针BTPENO2@F127在615 nm处表现出最大的吸收。对H2O2反应后，最大吸收红移至约680 nm，吸收带范围为600 ~ 850 nm。从图2f, g中可以明显看出，随着H2O2浓度的增加，吸收光谱发生红移，680 ~ 850 nm处的吸光度明显增加。这些数据清楚地表明，荧光强度的增加是由于探针对H2O2的响应。BTPE-NO2@F127纳米探针在680-900 nm范围内与不同浓度的H2O2孵育后的光声强度见图2h。光声强度与H2O2浓度(0 ~ 100μm)呈明显的线性关系(图2h)。此外，在808 nm激光连续照射60分钟(图2i)下，纳米探针BTPE-NO2@F127与H2O2和其可激活形式BTPE - NH2相比，具有更好的光稳定性。

图2：纳米探针的表征。(a) BTPE-NH2在DMSO/H2O混合物中与不同水组分的NIR-II荧光光谱。(b) BTPE- NH2的荧光强度与水馏分的关系图。(c)纳米探针的DLS和TEM图像。(d)BTPE-NO2@F127与不同浓度H2O2孵育90分钟后的NIR-II荧光光谱。(e)纳米探针在不同浓度的H2O2处理后在1028nm处的荧光强度。(f )BTPE-NO2@F127在不同浓度的H2O2中的吸收光谱。(g)纳米探针BTPE-NO2@F127在不同H2O2水平下的吸光度。(h)纳米探针与不同浓度的H2O2孵育后的相对光声强度(i)BTPE-NH2、BTPE - NO2与H2O2、ICG共孵育的光稳定性。

基于上述令人鼓舞的结果，证实了纳米探针BTPE-NO2@F127可以有效地响应H2O2，从而产生NIR-II荧光和光声信号，作者将该纳米探针应用于几种炎症疾病的诊断。图3和图4显示了利用BTPENO2@F127探针对间质性膀胱炎小鼠模型进行成像。间质性膀胱炎是一种以盆腔疼痛、尿频尿急为特征的膀胱炎症性疾病。这种疾病很难诊断，因为目前还没有专门的临床试验来诊断这种疾病。间质性膀胱炎患者膀胱内活性氧(包括H2O2)的生成增强，因此H2O2可作为该疾病的原位生物标志物。因此，作者可以使用纳米探针BTPE-NO2@F127通过响应原位生物标志物H2O2来诊断间质性膀胱炎。环磷酰胺(CYP，商品名Cytoxan或Neosar)是一种FDA批准的化疗药物，诱导间质性膀胱炎是其众所周知的不良反应之一。因此，我们通过腹腔注射不同剂量的CYP建立间质性膀胱炎小鼠模型。如图3a所示，当雌性小鼠腹腔注射CYP 24小时后，将纳米探针BTPE-NO2@F127注射到小鼠体内，然后进行NIR-II荧光成像和MSOT成像。从NIR-II荧光成像结果(图3b)可以看出，荧光强度随时间逐渐增加，在注射BTPENO2@F127后约90min达到最大，然后由于代谢作用逐渐减弱。膀胱内过表达的H2O2激活纳米探针，发出NIR-II荧光信号。在BTPE-NO2@F127注射90 min后，高剂量CYP组(150 mg/kg)比低剂量CYP组(75 mg/kg)和正常对照组(健康小鼠)表现出更高的荧光强度，提示高剂量CYP对膀胱区域造成更严重的损伤。

图3：纳米探针BTPE-NO2@F127通过NIR-II荧光成像在间质性膀胱炎小鼠模型中的应用。(a)间质性膀胱炎小鼠模型建立及成像实验示意图。(b)在BTPE-NO2@F127注射后不同时间点NIR-II成像。

用BTPENO2@F127探针对间质性膀胱炎小鼠模型进行MOST成像（图4a）,对对照组和间质性膀胱炎模型小鼠的膀胱组织进行组织学分析(H&E染色)(图4b)。可以清楚的看到，在CYP治疗的模型组中，可以观察到出血、水肿和尿路上皮脱落，且CYP剂量越大，情况越严重。这些结果证实了纳米探针BTPENO2@F127可以通过响应原位生物标志物H2O2来检测膀胱炎症，从而通过NIR-II荧光和MSOT成像对间质性膀胱炎进行无创诊断。

图4：纳米探针BTPE-NO2@F127在间质性膀胱炎小鼠模型中的MSOT成像应用(a)和H&E分析(b)

用BTPE-NO2@F127探针对肝损伤小鼠模型成像结果如图5所示。曲唑酮是临床用于治疗抑郁症的药物，日剂量过大会引起肝损伤。众所周知，在肝损伤时，ROS在肝区过表达，因此肝脏H2O2可作为肝损伤或损伤的内源性生物标志物。用曲唑酮(其结构如图5a所示)连续3天腹腔注射不同剂量的曲唑酮刺激雄性小鼠肝损伤。最后一次注射曲唑酮后6 h(第三天)，采用Elisa试剂盒检测各组血清ALT水平。观察到小鼠血清ALT水平随曲唑酮剂量的增加而升高(图5b)，证实了肝损伤的严重程度随曲唑酮剂量的增加而增加。接下来，我们使用纳米探针BTPE-NO2@F127来成像肝脏损伤。图5c显示了对照组和给予不同剂量曲唑酮组小鼠静脉注射BTPE-NO2@F127后0分钟和120分钟时的NIR-II荧光图像。曲唑酮组小鼠在注射纳米探针BTPE-NO2@F127前0 min无荧光，注射纳米探针BTPENO2@F127后120 min，荧光强度随曲唑酮剂量的增加而增加。图5d给出了肝脏区域感兴趣区域(ROI)的量化强度(图5c)，为荧光图像提供了直观的数据。纳米探针BTPE-NO2@F127作用120min后，不同组小鼠切除器官(肾、心、肝、肺和脾)的荧光强度如图5e所示，这些器官的NIR-II荧光图像如图5f所示。肝脏的荧光明显强于心、脾、肺、肾等其他主要器官，不同剂量曲唑酮处理组的荧光强度呈剂量依赖性。图5g为不同组小鼠肝脏区域的三维正交视图MSOT图像，能够反映不同组小鼠肝脏损伤的三维信息。可见，未注射曲唑酮的小鼠在注射纳米探针后，肝脏区域出现微弱的MSOT信号，这是由于健康小鼠肝脏区域存在较低的ROS(包括H2O2)水平。实验组接受不同数量的曲唑酮(50,100或200mg/kg)治疗,在他们的肝脏区域发现显著MSOT信号, 高剂量曲唑酮治疗组小鼠的信号更强,表明高曲唑酮剂量的小鼠遭受更严重的肝损伤。这些结果表明，MSOT成像可以在时空上检测肝损伤引起的肝区H2O2水平的升高。随后，分别对给予0、50、100和200 mg /kg 曲唑酮预处理的小鼠实施安乐死，获得其肝脏组织，对不同组小鼠肝脏组织切片进行组织学分析(H&E染色)(图5h)。对照组肝组织切片显示形态正常，无明显畸变，而曲唑酮组肝组织切片显示核胞浆分离、空泡化和水变性，这表明高剂量曲唑酮可加重肝损伤的严重程度。

图5：纳米探针BTPE-NO2@F127在曲唑酮肝损伤小鼠模型中的应用。(a)曲唑酮的分子结构。(b)各组血清谷丙转氨酶水平。(c)卤素灯(作为亮场图像)和NIR-II荧光图像。(d )c组小鼠肝脏部位ROI处平均NIR-II荧光强度。(e) f对应NIR-II荧光图像的主要器官NIR-II荧光强度均值。(f)不同组在静脉注射BTPE-NO2@F127后120分钟内解剖器官(心、肝、脾、肺、肾)的代表性离体NIR-II荧光图像。(g) BTPE-NO2@F127注射后120分钟小鼠的典型3D MSOT图像。(h)各组肝切片H&E染色

此外，作者使用纳米探针来成像肝缺血再灌注损伤(I/R)。肝缺血再灌注损伤(I/R)是临床各种情况下的主要并发症，如肝切除术、肝移植、失血性休克、复苏和创伤手术等，也是肝移植排斥反应导致死亡的主要原因。在肝I/R损伤的情况下，ROS(包括H2O2)在肝区过表达，导致局部炎症反应和细胞凋亡，进一步加重肝损伤。在这里，作者利用纳米探针BTPENO2@F127检测其对肝脏H2O2响应的肝损伤程度。小鼠分别缺血0 min(假手术组为对照组)、30 min或60 min，然后再灌注24 h。图6a为小鼠肝脏I/R过程。在缺血的情况下，肝脏因供血受阻而呈苍白色，取下血管钳，可见血流灌注明显。将纳米探针BTPE-NO2@F127静脉注射到假手术组和I/R模型组小鼠，分别进行MSOT成像和NIR-II荧光成像。老鼠的肝脏区域的NIR-II荧光图像和荧光强度显示在图6 b, c。假手术组小鼠的肝脏区域显示微弱荧光，I/R模型组在注射纳米探针BTPE-NO2@F127后90分钟或120分钟时肝脏的缺血区域显示明显的荧光。长时间缺血组(缺血60min)比短时间缺血组(缺血30min)荧光强度更高，这是因为长时间缺血组肝脏产生的H2O2更多，缺血时间更长，相应的肝脏损伤更严重。在I/R过程中缺血30min或60min组(图6d)，肝脏主要器官之间的荧光更强，这与体内成像结果一致。

图6：纳米探针BTPE-NO2@F127通过NIR-II荧光成像在肝脏缺血-再灌注损伤小鼠模型中的应用。(a) I/R过程手术照片(b)假手术组(缺血0分钟)和I/R模型小鼠(缺血30分钟或60分钟后再灌注24小时)静脉注射BTPE-NO2@F127纳米探针后不同时间点的NIR-II荧光图像。(c) b对应ROI(蓝圈)的肝脏区域的平均NIR-II荧光强度。(d)不同小鼠组在静脉注射BTPENO2@F127纳米探针120 min后解剖主要器官(肾、肺、脾、心、肝)的代表性离体NIR-II图像。I缺血，R再灌注。

然后，利用纳米探针BTPE-NO2@F127进行MSOT成像检测肝脏I/R损伤。相关数据如图7a所示。图7a为不同组小鼠静脉注射BTPE-NO2@F127后不同时间点的MSOT横切面图像。肝脏区域ROI MSOT强度的量化数据见图7b。作为器官位置的参考，雄性小鼠对应于小鼠肝脏区域的冷冻切片图像如图7c所示。对照组(假手术组)在静脉注射BTPE-NO2@F127纳米探针后120 min肝区未出现明显的MSOT信号(图7a、b)，而缺血组小鼠在120 min时出现明显的MSOT信号，提示肝损伤的形成。长缺血组(缺血60min)肝区信号较对照组(缺血0min)和短缺血组(缺血30min)明显。为了验证I/R过程与肝损伤的关系，我们用Elisa试剂盒测定了血清中ALT和AST的酶活性。I/R过程导致这些血清酶活性显著增强(图7d)，证明肝功能障碍与I/R过程确实存在直接相关性，结果与文献报道相似。图7e为I/R过程不同组小鼠(sham组、shore缺血组、long缺血组)静脉注射纳米探针BTPENO2@F127后120 min的3D MSOT图像。接受I / R组长时间缺血(60分钟),受伤的肝脏可以明显观察到MSOT信号很强,这是由于长时间缺血受伤的肝脏的体积(大小)大于短时间缺血(30分钟)的肝损伤体积。然后，对安乐死后不同组小鼠解剖器官进行MSOT成像(附图41、42)。缺血30、60 min的I/R组肝脏MSOT信号明显高于其他器官，验证了体内成像观察结果。并对不同组小鼠的肝脏进行切片组织学分析(图7f)。与假手术组相比，长缺血组(60 min)和短缺血组(30 min)炎症细胞浸润和空泡变性明显，且长缺血组较短缺血组更为严重。提示I/R过程小鼠肝损伤严重。

图7：纳米探针BTPE-NO2@F127在MSOT成像小鼠肝脏缺血-再灌注损伤模型中的应用。

(a)不同组在静脉注射纳米探针BTPE-NO2@F127后0min和120min MSOT图像(I缺血，R再灌注)。器官标记:“1”代表脊髓。(b) a.对应ROI(白色虚线)的平均MSOT强度。(c)雄性小鼠冷冻切片图像(d)各组小鼠血清ALT、AST两种酶水平。(e)BTPE-NO2@F127纳米探针注射后120分钟，不同组的典型3D MSOT图像。“1”代表脊髓。(f)各组小鼠肝脏切片代表性H&E染色I缺血，R再灌注，MSOT多光谱光声断层扫描。

参考文献

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