本文要点:第二近红外窗口(NIR-II)荧光成像技术以其高灵敏度、高分辨率、可深入组织等特点,在体内的各种应用中成为一项新兴技术。本文报道了一种以[1,2,5]噻二唑[3,4f]苯并三唑(TBZ)取代BBTD作为电子受体的NIR-II荧光分子的合理设计和合成。由于TBZ核的电子缺陷比BBTD弱,新制备的NIR-II分子基纳米粒子在水中具有更高的质量消光系数和量子产率。NIR-II BTB纳米颗粒可以进行视频率荧光成像,用于小鼠耳朵、后肢和大脑的血管成像。此外,它在NIR-I区的巨大吸收率也促进了使用光声显微镜(PAM)和层析成像(PAT)的生物成像。在与Arg-Gly-Asp(RGD)肽表面偶联后,功能化的纳米颗粒确保了通过二维和三维图像方式对整合素过表达的肿瘤进行靶向检测。因此,对有机荧光团工程受体的研究提供了一种很有前途的分子设计策略,可以为多种生物医学成像应用提供新的NIR-II荧光。
光声成像(PAI)可以提供精确描述人体大小的三维图像。NIR-II区域具有衰减的光散射和背景自发荧光,NIR-II成像在显示深部解剖特征方面显示出巨大的潜力,具有高灵敏度和清晰度,提供了传统荧光成像技术不能很容易揭示的生物体内的关键信息。NIR-II FLI和NIR-I PAI相结合的双模式成像,发挥了各自的优势,弥补了各自的固有缺陷,提高了成像的准确性,在有效的肿瘤诊断中具有广阔的应用前景。为了获得NIR-II发射,一种强缺电子单元,苯并双噻二唑(BBTD),已被广泛用作受体(图1a)。由于分子内电荷转移(ICT)效应的存在,这些荧光团通常在水相中存在低的量子产率(QYS)。发展了许多策略来增强QYS,包括染料与蛋白质疏水结构域的杂交,在分子结构中引入屏蔽单元等。大多数报道的D-A-D结构的NIR-II荧光团的QYS仍然相对较低,因为它们固有的ICT效应。因此,探索新的受体单元对于为实际应用提供更多可供选择的NIR-II有机分子设计策略具有重要意义。
方案1 :BBT的合成路线
考虑到电荷转移能力的强度可以通过改变受主单元来调节,用相对较弱的受主取代BBTD是一种很有前途的抑制ICT效应的方法,可以用增强的NIR-II荧光基团的QY来抑制ICT效应。本文以噻二唑苯并三唑为受体,通过对受体单元的合理设计,合成了一种新型D-A-D结构的近红外荧光载体,苯并三唑(BTB),并将其制备成纳米粒子(BTB NPs),用于双近红外光声/近红外II荧光成像。还利用RGD共轭的BTB纳米粒子实现了靶向肿瘤成像。该研究为设计和合成用于高级生物医学研究的新型NIR-II荧光载体打开了一扇新的大门。
图2:(A)BTB NP示意图(B)使用DLS测量水中BTB NPs的大小(C)BTB NPs的TEM图像(D)BTB纳米粒子(黑色)和BBT纳米粒子(红色)在水中的归一化UV-VIS-NIR和PL光谱(E)积分荧光强度曲线图(F)BTB在甲苯中、BTB纳米粒子在水中和BBT在甲苯中的量子产率(G)BTB NPs在水中的PA光谱(62.5µg mL-1),与纯水形成对比(H)在730 nm激发时,PA信号强度随BTB纳米粒子浓度的变化(I)在730 nm激发下,鸡胸组织中不同深度的BTB纳米粒子(62.5µgmL-1)的PA信号
通过改进的纳米沉淀法(图2a)制备了可水分散的纳米粒子。先考察了BTB和BBT在甲苯中的吸收光谱和发射光谱,以及它们在水中的吸收和发射光谱,考察了受体单元对分子光学性质的影响。首先这两个分子的吸收光谱都显示出两个吸收带:第一个吸收带在30 0~5 0 0 nm范围内可归属于共轭骨架的π-π*和n-π*跃迁,第二个吸收带在5 0 0~1 1 0 0 nm范围内,这表明这两个分子在极性较弱的溶剂中表现出比在极性溶剂中更强的荧光。此外,与它们的甲苯溶液相比,这两种纳米粒子在水中的吸收光谱都发生了展宽和红移,这归因于纳米粒子形成时的紧密分子堆积行为。其次,与BBT纳米粒子相比,BTB纳米粒子在730 nm处有蓝移的吸收峰,但在水中的最大吸收处的消光系数约为2.4倍(BTB纳米粒子在730 nm处的消光系数为19.6L g-1 cm-1,而BBT纳米粒子在808 nm处的消光系数为8.2L g-1 cm-1)。第三,BTB纳米粒子有很强的发射,峰值位于898nm,尾部密集延伸到1400 nm,而BBT纳米粒子的发射光谱在相同条件下仍然无法检测到(图2d)。将BTB纳米粒子封装成纳米粒子后,QY降至0.48%(图2e-2f),而BBT纳米粒子由于荧光很弱,无法计算其量子效率。与BBT相比,BTB及其NPs的QY更高,这可以归因于以TBZ为接受者的ICT效应的降低。基于以上观察结果表明,BTB纳米粒子适合于生物医学成像,TBZ部分是构建明亮的NIR-II荧光载体的一种有前途的候选材料。
图3:(A)小鼠尾静脉注射BTB NPs的示意图(b-d)静脉注射100g的BTB NPs后,小鼠后肢血管(B)、耳血管(C)和脑血管(D)的代表性近红外-II荧光图像(E)皮下注射BTB NPs用于淋巴成像的示意图(F)注射BTB NPs的小鼠淋巴管和淋巴结的代表性NIR-II荧光图像(G)经尾静脉注射BTB NPs的小鼠耳血管(H)和脑血管(I)的PAM成像中,沿红线的横截面荧光强度剖面(和高斯拟合),以绿色圈出
为了评估BTB纳米粒子在动物循环系统成像中的潜力,我们分别使用定制的动物荧光成像系统和PAM,通过NIR-II荧光和NIR-I PA技术在小鼠身上进行了血管成像。对静脉注射BTB NPs(1000LP)的C57BL/6J小鼠进行了耳部、后肢和脑内血管网的实时视频速率NIR-II荧光成像。注射NP后10min(50g/只),在功率密度为100mW cm-2的785 nm激发下,可清晰显示后肢、耳和脑的血管构筑(图3a-d)。结果表明,后肢血管、耳血管和脑血管的荧光谱半高宽分别为76.0、71.6和110.3m,具有较高的灵敏度和良好的空间分辨率。此外,经小鼠侧腹皮下注射BTBNPs时,注射部位附近的淋巴结被点亮,显示淋巴管的分辨率高,半高宽为454.0m(图3e-g)。然后,使用PAM进一步展示了BTB纳米颗粒在体内血管成像中提供的良好的空间和时间分辨率。将裸鼠麻醉后置于成像阶段,然后对耳部和脑部的血管进行成像。静脉给药时,在730 nm脉冲激光激发下,血管被点亮并清晰地观察到(图3h-i)。在PAM下测得耳血管的半高宽为223.0m,优于文献中在PAT下获得的分辨率。16在去除头皮的脑血管成像中,横窦和上矢状窦都能清楚地显示出来(图3I)。此外,大脑下静脉也发出PA信号。
图4:(A)在808 nm半导体激光器(140 mW cm-2)激发下,在143B荷瘤小鼠中使用BTB NPs超过72小时的代表性NIR-II FLI;(滤光片:1000 nm长通。箭头表示皮下肿瘤(每组4例)比例尺:5 mm(B)基于BTB NPs的143B肿瘤显像的T/NT比值超过72h(C)注射BTB(左,Video S1)或BTB-RGD NPs(右,Video S2)48h后,小鼠143B肿瘤光声图像(激发波长为730 nm)的三维体积再现,比例尺=2 mm
为了提高成像探针在肿瘤部位的聚集,实现体内准确诊断,将精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp,RGD)肽作为靶向配体修饰到BTB-NP表面,制备BTB-RGD纳米粒。首先研究了共聚焦图像,以证实BTB-RGD纳米颗粒对肿瘤细胞的靶向能力。与40μg mL-1的BTBRGD纳米颗粒单独孵育后,癌细胞的荧光信号明显高于无功能的BTB纳米颗粒对照组。相比之下,正常3T3细胞与BTB-RGD纳米颗粒孵育后的荧光强度与BTB-RGD纳米颗粒孵育后的荧光强度无明显差异。这些结果表明,RGD功能化纳米探针的靶向性可以促进αvβ3整合素高表达的肿瘤细胞对RGD48、49特异性结合的肿瘤细胞的细胞内化。在裸鼠皮下接种143B骨肉瘤细胞和PC3前列腺癌细胞后,检测了肿瘤的靶向性,结果表明,RGD功能化纳米探针的靶向性可以促进RGD48、49整合素高表达的肿瘤细胞对RGD48、49的靶向性。每种肿瘤分别用两组荷瘤小鼠证实BTB-RGD纳米粒(每组4只)的靶向性。如图4a-b所示,荷瘤小鼠在注射BTB-RGD NP后48h,肿瘤部位的NIR-II荧光信号逐渐增强,并达到最大值。然而,注射BTB NPs的小鼠肿瘤部位的信号在试验期内只显示出有限的增强。此外,注射BTB-RGD纳米粒的小鼠肿瘤部位的荧光强度在各时间点均高于对照组。
量化分析表明在143B和PC3肿瘤模型中,BTB-RGD NP治疗组小鼠的平均信号背景比(T/NT)分别为~14.2和8.1,而相应的BTB-RGD NP治疗组小鼠的平均信号背景比(T/NT)仅为5.0和4.9。对体外荧光成像结果的定量分析表明,注射BTB-RGD纳米颗粒的小鼠的这些器官和组织都发出了不同信号强度的荧光。注射的BTB-RGD纳米粒主要分布于肿瘤、肝脏、脾脏和淋巴结。皮肤样本也显示出荧光信号,表明btb-RGD纳米粒由于与皮肤组织中表达的整合素αvβ3具有很高的结合亲和力而被保留。除了荧光成像外,光声断层扫描(PAT)也被用来进一步证实btb-RGD纳米粒在肿瘤部位的整体靶向作用(图4c)。这些结果成功地展示了BTB纳米粒子在双模式生物成像应用中的巨大潜力。
一方面,利用NIR-II荧光成像的高灵敏度,成功地实现了肿瘤边缘的二维清晰可视化。另一方面,虽然与荧光成像相比,PAT的时间分辨率和灵敏度相对较低,但它可以提供更好的空间分辨率和三维可视化。这有利于肿瘤组织体积图像的重建,具有很高的临床应用价值。例如,医生可以在三维上评估肿瘤组织的体积信息,并在单次注射造影剂后进行荧光成像引导的肿瘤切除手术。因此,使用单一造影剂将这两种成像方式结合起来,为精确的血管成像和癌症治疗提供了很好的机会。
参考文献
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NIR-II in vivo imaging system
高灵敏度 - 采用Princeton Instruments深制冷相机,活体穿透深度高于15mm
高分辨率 - 定制高分辨大光圈红外镜头,空间分辨率优于3um
荧光寿命 - 分辨率优于 5us
高速采集 - 速度优于1000fps (帧每秒)
多模态系统 - 可扩展X射线辐照、荧光寿命、一区荧光成像、原位成像光谱,CT等
显微镜 - 近红外二区高分辨显微系统,兼容成像型光谱仪
有不同型号的样机可以测试,请联系:
艾中凯(博士)
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恒光智影
上海恒光智影医疗科技有限公司,专注于近红外二区成像技术。致力于为生物医学、临床前和临床应用等相关领域的研究提供先进的、一体化的成像解决方案。自主研发近红外二区小动物活体荧光成像系统-MARS。
与基于可见光波长的传统成像技术相比,我们的技术侧重于X射线、紫外、红外、短波红外、太赫兹范围,可为肿瘤学、神经学、心血管、药代动力学等一系列学科的科研人员提供清晰的成像效果,助力科技研发。
同时,恒光智影还具备探针研发能力,我们已经成功研发了超过15种探针,这些探针将广泛地应用于众多生物科技前沿领域的相关研究中。
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