本文要点：对于一些肿瘤组织和细胞，低氧的微环境赋予癌细胞对癌症化疗和放疗更高的抵抗力，已知低氧程度与肿瘤标志物硝基还原酶(NTR)的表达直接相关。但是目前现有的大多数NTR荧光探针的灵敏度仍然不足以检测普通生物系统中痕量的NTR。而且，临床上手术切除肿瘤是治疗癌症的有效方法，但是，肿瘤边缘的精确描绘仍然是一个挑战。
第二近红外窗口(NIR-II，1000–1700nm)中的荧光成像显示出较少的光散射以及在活组织中可忽略的背景自荧光，从而导致更深的穿透深度和更高的时空分辨率。因此，非常需要开发近红外II区的灵敏的NTR荧光开-关探针，以精确描绘肿瘤边缘。作者报道了一种新型的用于肿瘤成像的硝基还原酶激活的近红外荧光探针RHC-NO2。该探针可以发射900–1300纳米范围内的荧光，并靶向NTR过表达的低氧肿瘤，虽然探针本身显示的荧光可以忽略不计；然而，在与NTR反应时，产生了大大增强的近红外荧光信号，检测限低至5.9ng/mL，比现有的NTR近红外二区（NIR-II）的荧光开-关探针低一个数量级左右(约50 ng/mL) 。RHC-NO2探针的高灵敏度使得通过检测低氧肿瘤中的NTR来精确地对肿瘤边缘成像成为可能，并且这种潜力已经被荷瘤小鼠模型的体内成像所证明。因此，作者认为该探针可能为肿瘤边缘的诊断研究提供一种方便的方法。
首先，作者使用氢化罗丹明聚甲川框架设计了发射峰在921 nm的RHC-NO2探针，该探针使用一个硝基作为NTR特异性识别部分以及荧光猝灭剂。当探针与NTR（硝基还原酶）反应时，硝基被还原成氨基，921 nm处的荧光被相应地恢复(方案1)。
方案1: 用于NTR（硝基还原酶）检测的RHC-NO2的传感机制。
在 p H 7.4的PBS中测得有和没有NTR（硝基还原酶）的探针的吸收光谱 。如图1A所示，探针RHC-NO2在677 nm处显示出最大吸收，添加NTR导致在868 nm处出现新的吸收峰，这可能归因于反应产物RHC-NH2的形成。图1B描述了有和没有NTR的RHC-NO2的发射光谱，尽管探针本身由于硝基的猝灭作用没有荧光 (量子产率Ф< 0.01%)，但与NTR的反应使其在921 nm产生强荧光(约14倍增强)。这些结果表明探针与NTR反应时可能产生RHC-NH2。
图1：RHC-NO2(10μM)与NTR(10μg/mL)在含有10%胎牛血清(FBS)的pH 7.4磷酸盐缓冲液中存在NADH (200 μM)的情况下反应前(a)和反应后(b)的吸收(A)和发射(B)光谱。
在优化的条件下(200 μM NADH，含10% FBS的pH 7.4的PBS中，37℃下反应1 h)，RHC-NO2在不同浓度NTR下的荧光响应如图2A和B所示，表明921 nm处的荧光强度随着NTR的增加而逐渐增加。在1-10 μg/mL范围内，△F和NTR的浓度有很好的线性关系，方程表示为：△F=1657×[C(μg/mL)]-730(R=0.004)，检测限低至5.9ng/mL，其中△F是在921 nm处有和没有NTR的RHC-NO2的荧光强度之差。这些观察结果表明，通过在近红外窗口中检测痕量浓度的NTR，RHC-NO2可用于体内成像。为了深入了解探针的选择性，在存在各种潜在干扰物质的情况下测试了荧光响应。如图2C所示，在测试的物质中没有检测到显著的荧光响应，被测试物质包括无机盐(Na2S、氯化钙、硫酸铜、硫酸亚铁、KCl、氯化镁、氯化锌)、维生素C、葡萄糖、活性氧(H2O2，N a O C l，N a N O2，·OH, ONOO-)和生物硫醇(半胱氨酸、谷胱甘肽)。相比之下，NTR的加入导致显著的荧光增加，表明即使在复杂的生物环境中，RHC-NO2也表现出对NTR的高选择性。
图2：(A)RHC-NO2(10 μM)对不同浓度NTR(0–10 μg/mL)的荧光响应。(B) △F对NTR浓度的线性拟合曲线
(C)RHC-NO2对各种物质(从1到18)的荧光响应:空白、半胱氨酸(1 mM)、谷胱甘肽(1 mM)、Na2S (100 μM)、维生素C (1 mM)、H2O2(100 μM)、NaOH(100 μ M)、NaNO2 (100 μ M)、·OH (100μM)、Ca2+(2 mM)、Cu2+(100 μM)、Fe2+(100 μ M)、葡萄糖(10 mM)、K+(150 mM)、Mg2+(2 mM)、Zn2+(100 μ M)、ONOO-(200 μ M)，NTR (10 μg·mL-1).
最后，作者将RHC-NO2探针应用于活体动物肿瘤的近红外荧光成像。在该实验中，选择携带皮下A549肿瘤的雌性BALB/c裸鼠作为模型，探针RHC-NO2静脉注射入A549荷瘤小鼠。从图3可以看出，在注射约12小时后，肿瘤中的荧光强度逐渐增加，并且检测到最大的NIR-II信号。然后，荧光随时间减少。最重要的是，注射4小时后肿瘤与周围的正常组织变得可区分，并且肿瘤边界保持清晰直到约24小时。值得注意的是，在注射探针后，除肿瘤区域外，在小鼠身体的其他部位也观察到荧光，这可能归因于探针通过肝脏和肾脏的代谢(这种代谢途径在先前报道的文献中非常常见)。此外，注射24小时后，肿瘤中的荧光保持明亮，而其他器官中的荧光变得相当弱。因此，可以选择24 h作为A549肿瘤荧光成像和鉴定的时间点。这些结果证明了RHC-NO2在生物成像中描绘肿瘤边缘的能力。
图3：A549荷瘤小鼠(n = 3)尾静脉注射RHC-NO2(200 μL，500 μ M)后的代表性NIR-II图像
解剖小鼠以分析探针在主要器官和肿瘤中的离体生物分布。发现在静脉注射RHC-NO2至A549荷瘤小鼠48小时后，在解剖的肿瘤、肝脏和肾脏中观察到NIR-II荧光(图4)。这可能是因为肝胆系统和肾脏系统中的这两个器官负责将探针从体内清除。上述结果表明，RHC-NO2可作为一种潜在的近红外荧光探针用于癌症治疗。
图4：在尾静脉注射RHC-NO2(200 μL ，500 μ M)后，RHC-NO2在A549荷瘤小鼠体内的离体生物分布。
(A)注射RHC-NO2 48小时后，解剖器官和肿瘤的近红外-II区荧光成像
(B)A549荷瘤小鼠(n = 3)的定量荧光强度。
参考文献
Zhang Xiaofan, et al."Sensitive imaging of tumors using a nitroreductase-activated fluorescence probe in the NIR-II window.." Chemical communications (Cambridge, England) .(2021): doi:10.1039/D1CC03232A.
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