本文要点：本论文中，研究人员利用单壁碳纳米管在1.3-1.4 µm (NIR-IIa)固有发射，首次在不开颅的情况下，实现脑穿透深度>2 mm，空间分辨率达10 µm的无创性脑血管成像；同时以每秒∼5.3帧的成像速率动态成功记录脑血管中的血液灌注，并实时监测脑卒中模型小鼠的血液动力学分布。
大脑的无损成像对于研究其复杂的功能及相关疾病具有重要作用。与传统的X光、磁共振等方法相比，光学成像具有扫描时间短、空间分辨率高、无离子辐射、操作简便等优势备受关注。然而，传统的可见光及近红外一区 (NIR-I, 400-900 nm)荧光成像常常需借助于开颅、打骨窗及磨颅骨等手术，这将对脑组织及脑血管造成损伤。近红外二区生物成像窗口(1.0 -1.7 µm, NIR-II)极大地减少了组织的光子散射、吸收和自荧光现象, 提供更高的信噪比和更深的组织穿透性，在生物领域中应用备受青睐。美国斯坦福大学戴宏杰教授团队利用单壁碳纳米管(SWNT) 在1.3-1.4 µm (NIR-IIa)固有发射，首次在不开颅的情况下，实现脑穿透深度>2 mm，空间分辨率达10 µm的无创性脑血管成像。
首先，研究人员测试了SWNT-IRDye800共轭物在808 nm激光激发下的发射谱图(图1a)。其中，IRDye800的发射波长位于NIR-I窗口(800–900 nm), 而SWNTs的发射波长位于NIR-II窗口(1.0-1.7 μm)。同时，研究人员利用1 wt% 脂肪乳剂来模拟生物体组织，将充满SWNT–IRDye800溶液的毛细管浸入其中，当浸入深度达1cm时，仅有NIR-IIa (1.3 -1.4 μm)成像窗口可见尖锐的毛细管边缘(图1b)，表明NIR IIa窗口具有较低的光散射。为了进一步阐明脂肪乳剂成像的波长依赖性，研究人员测定了1 wt% 脂肪乳剂的散射系数与波长关系。结果表明，光子散射系数与波长成反比(图1c)。NIR-IIa 窗口由于避免了短波光子(<1.3 μm) 散射引起的背景信号以及水分子干扰信号(>1.4 μm)，从而大大改善成像效果。
图1 a、SWNT-IRDye800荧光发射光谱 (808 nm)。b、 SWNT-IRDye800溶液充满毛细管浸入1wt% Intralipid中1mm (上)和10mm (下)的NIR荧光图像。c、1wt% Intralipid在水中的消光光谱(黑色曲线)和散射光谱(红色曲线)。
其次，研究人员利用SWNT–IRDye800分别在NIR-I、NIR-II和NIR-IIa成像窗口进行了活体小鼠脑成像对比。与NIR-I窗口成像的模糊血管相比 (图2b)，检测波长越长，图像越清晰(图2c)，尤其是NIR-IIa (1.3 -1.4 μm) (图2d)。研究人员通过测定小鼠头皮和颅骨的消光光谱进一步解释小鼠大脑荧光成像的波长依赖性 (图2e)。在NIR-IIa波段内，头皮及颅骨的光散射系数低于传统NIR-I窗口 (图2f)，同时避免了头皮及水分子振动吸收峰干扰 (> ∼1.4μm)，从而使得颅骨下方的皮质血管成像得到显著改善 (图2d和2b)。
图2、SWNT-IRDye800在不同近红外成像窗口的活体小鼠脑成像。a，去除毛发的C57Bl/6小鼠脑部。b–d，同一小鼠脑部在NIR-I、NIR-II和NIR-IIa区域的荧光图像。d，大脑下静脉、上矢状窦和横窦分别标记为1、2和3。e，头皮(红色)和头骨(蓝色)的消光光谱以及吸水光谱(黑色)。f，头皮(红色)、颅骨(蓝色)和脑组织(黑色)的散射系数μs′与波长作图。
接下来，研究人员对小鼠脑血管进行高倍显微成像。为了优化单位质量注入的纳米管的荧光信号，研究人员将纳米管中荧光发射在1.3–1.4 μm波段的半导体纳米管分离出来，用于小鼠脑成像(图3c)。首先，研究人员对小鼠整个头部进行成像(图3d)，放大其左半球(图3e)，并在上矢状窦皮质血管分支附近进行显微成像。头皮下方2.6 mm深度处NIR IIa 窗口显微图像揭示，许多微小的毛细血管从较大的脑血管分支出来（图3f）。此外，研究人员通过测定离体的头皮、颅骨和脑膜总厚度，推测出2.6 mm深度的毛细血管在脑组织内的深度为∼1.3 mm，实现了迄今为止报道的最高分辨率的脑毛细血管非侵入性荧光成像（图3h-k）。
图3、小鼠脑血管NIR IIa高倍显微荧光成像。a、立体定向显微镜成像装置。红色激光用于校准并显示光束位置。b、显示NIR IIa荧光穿透脑组织、颅骨和头皮的示意图。c、 半导体纳米管在水溶液中的发射光谱。1.3–1.4 μm NIR IIa区域为红色。d、低倍脑血管图像，视野为25 mm×20 mm。e、d中脑血管图像放大到左大脑半球，视野为8 mm×6.4 mm。f、用显微镜物镜拍摄同一小鼠头部的脑血管图像，视野为1.7 mm×1.4 mm。这些病灶内血管特征的深度为2.6 mm。g、放大倍率较高的物镜拍摄的f子区域的放大图像，视野为0.80 mm×0.64 mm。注：沿黄色虚线的横截面强度分布（黑色）和高斯拟合曲线（红色）。h–k，在另一只小鼠（h，j）上拍摄的另外两张视野为0.80 mm×0.64 mm的高分辨率脑血管图像及其沿黄色虚线（i，k）的横截面荧光强度分布（黑色）和高斯拟合曲线（红色）。
最后，研究人员对正常小鼠与左脑中风小鼠(MCAO) 进行了脑血流灌注的动态NIR-IIa成像；并根据血流动力学差异来区分动脉血管和静脉血管。与正常小鼠(图4a-c)相比，MCAO小鼠(图4g-i)右半球显示出与正常小鼠非常相似的血流，而左半球却显示出明显的血流延迟。MCAO小鼠的主成分分析(PCA)显示，右大脑半球的静脉血管网(蓝色) 较左大脑半球的静脉血管网(蓝色)更为丰富，且动脉血管(红色)仅在完整的右大脑半球显示(图4j-l)。进一步对脑血流灌注进行量化发现，正常小鼠中，左右大脑半球中线性上升的荧光信号具有几乎相同的斜率，表明相对灌注为∼1 (图4m); 而在MCAO小鼠中，左半球的相对灌注仅为0.159 (图4n)。与脑灌注不足模型小鼠相比，MCAO组血液灌注显著减少∼85% (图4o)，利用荧光信号定量的方法与激光多普勒测量结果一致。因此，NIR-IIa动态荧光成像为血流测定提供一种新的方法。
图4、小鼠脑血管的动态NIR IIa荧光成像。a–c，正常小鼠NIR IIa图像。d–f，PCA重叠图像显示正常小鼠的动脉(红色)和静脉(蓝色)血管。g–i，MCAO小鼠的NIR IIa图像。j–l，PCA重叠图像显示MACO小鼠的动脉(红色)和静脉(蓝色)血管。m、 n，正常小鼠(m)和MACO小鼠(n)左侧 (红色)和右侧 (黑色)大脑半球的NIR-IIa信号随时间的变化。o、采用NIR-II法(红色)和激光多普勒血流频谱(蓝色)测定对照组(n=3)、MCAO组(n=4)和低血流灌注组(n=4)左大脑半球平均血流灌注。
参考文献
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NIR-II in vivo imaging system
高灵敏度 - 采用Princeton Instruments深制冷相机，活体穿透深度高于15mm
高分辨率 - 定制高分辨大光圈红外镜头，空间分辨率优于3um
荧光寿命 - 分辨率优于 5us
高速采集 - 速度优于1000fps （帧每秒）
多模态系统 - 可扩展X射线辐照、荧光寿命、一区荧光成像、原位成像光谱，CT等
显微镜 - 近红外二区高分辨显微系统，兼容成像型光谱仪
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艾中凯(博士)
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恒光智影
上海恒光智影医疗科技有限公司，专注于近红外二区成像技术。致力于为生物医学、临床前和临床应用等相关领域的研究提供先进的、一体化的成像解决方案。自主研发近红外二区小动物活体荧光成像系统-MARS。
与基于可见光波长的传统成像技术相比，我们的技术侧重于X射线、紫外、红外、短波红外、太赫兹范围，可为肿瘤学、神经学、心血管、药代动力学等一系列学科的科研人员提供清晰的成像效果，助力科技研发。
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